摘要

 本文首次描述了一種與磷脂質相關的高通量熒光。陰離子兩親磷脂可以在水溶液中形成復合物，其臨界膠束濃度(CMC)可以使用熒光探針N,N-二甲基-6-丙酰-2-萘胺(Prodan)測定。在與候選藥物相互作用時，由于脂質和候選藥物之間的關聯，該CMC可能會轉變為較低的值，相互作用越強，轉變越大。藥物的代謝可以根據代謝速率和代謝物的性質改變磷脂質的程度。我們使用這種熒光方法從45種藥物和10種藥物的代謝物獲得的數據證明了與人體研究、體內測試和細胞分析報告的磷脂沉積癥有良好的相關性。因此，該測定提供了一種快速、可靠且具有成本效益的篩選工具，用于早期預測候選藥物的磷脂沉積誘導潛力。

 藥物誘導的磷脂病(PLD)，雖然不這么叫，但在1948年Nelson和Fitzhugh首次報道了長期服用氯喹的大鼠的泡沫巨噬細胞。1后來的研究表明，陽離子兩親藥物（CADs)負責誘導細胞中的這種脂質積累，并導致存在主要成分為溶酶體的層狀包涵體。2-5 PLD背后的機制尚不完全清楚。兩個主要假設包括(i)CAD和磷脂之間通過疏水和靜電相互作用結合，導致溶酶體磷脂酶無法消化藥物脂質復合物，以及(ii)CAD直接抑制脂質消化酶。3，6-9沒有明確的證據表明藥物誘導的PLD與細胞毒性有關。這種脂質儲存障礙被認為是細胞對CAD暴露的適應性反應10而不是毒理學表現，并且在給藥終止后是可逆的。11,12由PLD引起的脂質代謝改變值得關注，因為它可能發生在包括肺、肝、腦、神經系統和淋巴系統在內的一系列組織類型。13在某些情況下，它會導致藥物和/或其代謝物在層狀體中積累高達毫摩爾濃度并導致細胞損傷。2,14因此，研究了化合物對PLD可逆性的程度和持續時間，以評估其安全范圍。在PLD的診斷中，需要通過透射電子顯微鏡(TEM)進行確認，這被廣泛接受為表征藥物誘導的脂質沉積的標準方法。9,15-18在TEM下，巨噬細胞中的洋蔥樣溶酶體是PLD的特征。然而，由于TEM成本高、需要犧牲實驗動物，以及研究與研究在實驗設計、劑量等方面的差異，TEM既不常見，也不容易滿足早期藥物發現和開發的要求。已經開發了諸如計算機評估、體外生物篩選和體內生物標志物等工具來滿足藥物發現和開發不同階段的需求，以預測或識別磷脂質沉積癥。由于CAD的特性，PLD的計算機模擬預測模型側重于篩選候選物的親脂性及其在中性13,19或較低pH值下的電荷，代表溶酶體中的條件。20后來的模型還包含詳細的化合物結構信息13或藥代動力學特性以提高可預測性。10雖然可用作第一層標記工具，但計算機模型應謹慎使用，因為它們可能會投影PLD快照，尤其是對于虛擬分子，而不是完整的機械評估，包括劑量依賴性和時間依賴性。此外，這些工具無法預測非CAD誘導劑，例如高度親水的慶大霉素。21

 圖1.用在不同檢測日期獲得的不同測試物品的平均CMC說明檢測的重現性。誤差棒代表標準偏差。

 在大多數制藥公司的PLD篩選策略中，下一級篩選分析是基于細胞的生物分析，在細胞內使用熒光脂質或親脂性染料。22-25最近報道了一種基于96孔的基因表達分析26；然而，該測定已被證明不太敏感。22直到最近，還沒有基于非細胞的體外篩選測定可用。已經報道了一種高通量langmuir-balance方法，將用測試化合物處理后臨界膠束濃度(CMC)的變化與在人類、動物和細胞中觀察到的PLD聯系起來。27這種方法大大提高了預測質量與計算模型相比，與細胞分析和動物模型相比，增加了吞吐量；然而，這種方法需要使用專門的設備，即八通道表面張力計（Delta 8，Kibron Inc.，Helsinki，Finland），這在大多數實驗室中并不容易獲得。

 在本報告中，我們描述了一種用于測定CMC的替代方法，因此與langmuir平衡方法相一致，藥物的磷脂生成潛力。我們使用熒光染料探針通過短鏈脂質的CMC變化來測量藥物脂質復合物的形成。一些熒光染料探針長期以來一直用于測定CMC，28,29包括脂質30,31，這是基于影響染料探針熒光發射的膠束形成后的微環境變化。所需的儀器是大多數生物學和生物化學實驗室都有的熒光讀板儀。

 藥物代謝至少可以通過兩種方式影響PLD。當形成CAD的極性代謝物時，它可以迅速排出體外，從而減少母體積累的可能性。另一方面，來自非CAD母體的陽離子兩親代謝物的形成也可以誘導PLD。32這種機制見解可能有助于解釋體外篩選結果與體內動物數據之間的脫節。出于這個原因，我們還研究了一些測試化合物的主要代謝物的磷脂生成潛力。

Delta-8使用新方法測試CMC，而不是表面張力測試法——摘要

Delta-8使用新方法測試CMC，而不是表面張力測試法——方法

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