結果和討論

 首先，給出了從表面壓力測量中獲得的壓縮等溫線，揭示了水、鈉和鈣溶液中脂質單層之間的宏觀差異。然后，我們使用熒光顯微鏡沿著壓縮等溫線觀察了結構域的形成，并跟蹤了當Ca2+離子結合到單層時結構域的變化。最后，利用VSFG在分子水平上闡明了陽離子-脂質相互作用。

 壓縮等溫線。圖2顯示了DPPC和DMPS單分子膜在不同亞相（凈水、1 M NaCl和1 M CaCl2溶液）上的Langmuir等溫線。對于此處使用的1 M NaCl和1 M CaCl2溶液，亞相中的氯離子濃度不同。由于氯離子與磷脂的配位作用較弱，因此可以忽略因氯離子濃度不同而產生的11種可能影響，這已通過使用0.5 M CaCl2溶液的對照實驗得到證實。

 圖2：DPPC（A）和DMPS（b）在不同亞相上的壓力面積（π-A）等溫線：凈水（藍色）、1 M NaCl溶液（綠色）、1 M CaCl2溶液（紅色）。沿等溫線顯示了液相膨脹相（LE）、液相凝聚相（LC）和兩相共存區（LE+LC）。ACa2+代表鈣離子的面積。

 在水上，DPPC的相行為已被充分記錄。23,25隨著表面積的減小，已確定以下區域：氣相、液相膨脹（LE）相、LE和液相冷凝（LC）相共存的平臺特征以及純LC相。

 由于亞相中存在鈉離子，DPPC的壓縮等溫線在LE和LE+LC區域移動到略高的表面壓力。之前也觀察到了同樣的效果30，這可以通過離子結合到LE相引起的脂鏈紊亂來解釋。在較高的表面壓力下，鈉對壓縮等溫線沒有影響，表明鈉離子與LC相沒有明顯的相互作用：離子可能正從頭群區域“擠出”。

 對于CaCl2溶液亞相，觀察到更顯著的效果。在這里，表面壓力在低得多的密度下變得有限(～140?2/分子），而從LE相到LE+LC共存區的轉變不太明顯。在LC區域（π>20 mN/m），鈣的存在導致脂質占據4?2/m的額外空間，這正是鈣離子的足跡。31這表明，在表面壓力超過20 mN/m時，使頭部基團水合的水被鈣離子取代。在更高的表面壓力（>25 mN/m）下，額外面積下降約2?2/脂。分子面積差異的變化可以用兩種方式來解釋：（1）從1:1到2:1脂質/Ca2+復合物的轉變，正如之前MD模擬所提出的那樣；11（2）脂質頭基構象的變化。6,23

 對于DMP，水上壓縮等溫線（圖2b）顯示出與DPPC相同的相行為，具有LE、LE+LC和LC區域。然而，壓縮后，每個分子可以達到更小的面積。這表明PS比PC更具可壓縮性，這與相鄰帶電頭基團之間的庫侖排斥作用應擴大每個PS分子面積的直觀表示相反。結果表明，相鄰PS頭基帶電部分的強分子間配位在面積減小中起作用。16

 對于1 M Ca2+溶液上的DMPS單分子膜，與觀察到的純水共存區的π）10 mN/M壓力相比，LE+LC平臺壓力降低到π）5 mN/M；在較高的表面壓力（π>20 mN/m）下，兩條等溫線的位移保持等于Ca2+足跡，4?2/脂，未觀察到明顯轉變為2:1脂/Ca2+復合物。

 熒光顯微鏡。利用熒光顯微鏡可以觀察到脂質單分子膜內的共存相。圖3顯示了三種典型表面壓力下，用熒光探針標記的DPPC和DMPS單分子膜沿等溫線獲得的熒光圖像。暗區對應于有序（LC）疇，亮區對應于無序（LE）疇。對于凈水子相（圖3中的左列），低表面壓力下的LC域為DPPC（圖3a）19的“豆”形和DMP的“花”形（圖3d）。隨著表面積的減少，LC域在凝聚成連續LC相（圖3c）之前通過有序脂質的狹窄區域相互連接（圖3b）33。從熒光圖像分析中獲得的有序暗區的歸一化面積Adark（圖4）表明，LC相在單層壓縮后增加，并在π>10 mN/m時覆蓋整個單層。

 圖3：水上DPPC（a、b、c）和DMPS（d）單層的熒光圖像（左圖）和1 M CaCl2溶液（右圖），π）4 mN/M（a）、π）6.5 mN/M（b）、π）35 mN/M（c）和π）2 mN/M（d）。單分子膜用5 mol%羅丹明PE標記：亮區對應于LE相，暗區為LC結構域。比例尺代表15μm。所有圖像的對比度都相同。

 當鈣存在于亞相時，PC和PS單分子膜在低表面壓力下都可以觀察到小的有序疇。更大面積的單層被這些～與水相比，Ca2+的有序疇為3.5μm（見圖4）。因此，低表面壓力下的這些小區域是鈣誘導的，它們占據～表面的30%（對于PC）和20%（對于PS）。從下面的VSFG測量中也可以明顯看出這些域的存在。到目前為止，這種鈣離子誘導的結構域僅在混合單層系統中觀察到。34,35在中等表面壓力下（5 mN/m<π<25 mN/m），從圖4可以明顯看出，Ca2+的作用是降低有序疇的密度。

 圖4：。在凈水（藍色）和1 M CaCl2溶液（紅色）上，DPPC（a）和DMPS（b）單分子膜的熒光圖像中暗有序LC域的部分面積Adark隨表面壓力的變化。注意周圍標記的局部最大值～在存在Ca2+離子的情況下，兩種脂質均為3 mN/m。

 振動和頻發生光譜學（VSFG）。VSFG是一種非線性振動光譜技術，可提供界面分子構象順序和方向的表面特定信息，進一步研究了在Ca2+存在下這種改變相行為的分子起源。21,22為了量化離子對脂質尾部構象的影響，在C-H拉伸區域收集VSFG光譜。沿等溫線測量了幾個表面壓力的光譜；圖5顯示了DPPC單層在20 mN/m和35 mN/m下三種不同亞相的光譜。可以觀察到五種振動模式：以2876、2970和2938 cm-1為中心的峰值分別歸屬于CH3對稱拉伸、CH3反對稱拉伸和CH3費米共振。22 CH2對稱和反對稱拉伸頻率約為2846和2920 cm-1。氘化DPPC脂質單層（d62和d75 DPPC）上的VSFG實驗顯示膽堿C-H伸展的信號非常低。

 圖5：。DPPC在π）20 mN/m（頂板）和π）35 mN/m（底板）時的VSFG光譜。垂直線表示亞甲基對稱拉伸（νsCH2）和甲基對稱拉伸（νsCH3）的位置。所有光譜均歸一化為z切石英的參考信號。實線表示使用洛倫茲模型擬合數據。

 單分子層壓縮后，CH2強度顯著降低。這可以從對稱性參數中理解：當烷基鏈中的亞甲基從順式構象變為反式構象時，會出現一個局部反轉中心，從而使CH2模式SFG無效。23另一方面，CH3強度隨著單層的壓縮而急劇增加，這是由于鏈傾角的角度分布變窄所致。CH3和CH2對稱拉伸振子強度可通過擬合數據獲得。考慮到前面的論點，CH3和CH2對稱拉伸振子強度的比值R為脂鏈的順序提供了一個靈敏的經驗度量。24為了可靠地提取R，使用洛倫茲多峰模型對數據進行全局分析（見支持信息中的公式2，實驗部分），僅允許峰值振幅隨表面壓力的變化而變化。DPPC和DMPS的R在圖6中繪制為表面壓力的函數。

 圖6：。作為DPPC（a）和DMPS（b）單分子膜表面壓力的函數，CH3和CH2對稱拉伸振子強度的比值R：純水（藍色）、1 M NaCl溶液（綠色）和1 M CaCl2溶液（紅色）。由于單分子膜的崩塌，在π）40 mN/m時，無法測定Na+-DPPC的比值R。由于壓縮單層膜的νsCH2振幅的不確定性，在較高壓力下，誤差條較大。插圖顯示了作為每種脂質面積函數顯示的比率R。請注意～4?2/脂質置換（解釋為Ca2+足跡），與圖2中的等溫線一致。

 對于純水和NaCl亞相上的DPPC單分子膜，R隨壓力以類似的方式變化，在鈉存在的情況下，R值稍小，但重復性較小。這表明，正如壓區等溫線也顯示的那樣，在Na+存在的情況下，DPPC單分子膜的有序性稍差，這與之前關于亞相中高濃度NaCl的報告一致，30但與分子動力學模擬不一致，11,13表明在～10 mN/m表面壓力。

 對于含有Ca2+離子的亞相上的DPPC，R在5 mN/m處顯示出一個小但可重復的峰值，隨后在10到20 mN/m之間略有下降，然后在25 mN/m左右急劇增加。在低表面張力下，按順序短暫增加(～5 mN/m）與熒光顯微鏡的結果非常一致，這表明在這些壓力下也會依次增加（圖6）。在下文中，我們將嘗試使用表面張力測量、熒光顯微鏡和VSFG測量的結果，提供單層相行為的統一圖片。我們將首先討論DPPC的具體結果，然后討論DMP。

 在VSFG測量中，當探測面積為～10-2 mm2，但隨著單層中平均階數的增加，R值出現峰值。進一步壓縮，誘導域合并成更大的域。同時，Adark增加，但Ca2+仍比水低20%（圖4a，10 mN/m<π<25 mN/m）。這再次與VSFG光譜很好地一致，VSFG光譜表明這些表面壓力下的脂質尾部更加無序，因為20 mN/m的CH2對稱和反對稱拉伸在亞相Ca2+中更加突出（圖5）。

 當表面壓力達到25 mN/m時，R急劇增加，達到一個恒定的大值。有趣的是，R的急劇增加與等溫線中脂質面積減少2?2/脂質的位置一致（見圖2），我們將其歸因于（見上文）從1:1脂質/鈣+復合物轉變為2:1復合物。這意味著順序的增加，即R的增加，涉及到由Ca2+-脂質相互作用的明顯變化引起的頭群的重新排列。當比較Ca2+溶液與純水時，從R值增加的不同點也可以明顯看出與Ca2+離子足跡相關的4?2/脂質表面積。當繪制R與每種脂質的面積之比時，R的增加精確地移動了一個單位的ACa2+（插圖6）。

 當Ca2+-DPPC體系（π）25 mN/m的比值R急劇增大時，20%的單層面積仍被LE相覆蓋。從VSFG獲得的比率R的增加并不是由于脂尾中的笨拙缺陷消失，而是由于LC相中的烷基鏈朝向鏈與表面法線之間的較小角度θ重新定向。這可以從νsCH3和甲基反對稱拉伸12的振幅之比得出結論（詳細信息見支持信息），這表明DPPC在Ca2+溶液中的θ比在純水中的θ小10°。在這些壓力下，鈣離子的存在導致脂質向表面法線協同傾斜。

 對于DMP，盡管其頭基結構和電荷不同，但Na+和Ca2+離子的結果與DPPC的結果非常相似。由于DMPS的非極性烴鏈長度略短（DMPS為14個碳，DPPC為16個碳），與DPPC相比，DMPS壓縮單層的R值較低。先前已經報道了烷基鏈的長度與單層的相對順序之間的直接相關性。36

 對于Ca2+，DMPS單分子膜的比率R與DPPC單分子膜的趨勢相似：在低表面壓力下出現峰值(～3 mN/m），并且在較高的表面壓力（π）30 mN/m時會出現急劇增加，ACa2+開始向每個分子的更高面積方向移動（插圖6）。同樣，這與等溫線數據和熒光圖像非常一致。對于高表面壓力（π>30mN/m）下的DMP，發現R與亞相中鈣的存在無關，表明在高壓下存在類似的酰基鏈排序。

 可以注意到兩種脂質之間的三個差異：首先，在5 mN/m<π<25 mN/m的區域，在熒光結果中，鈣誘導的DPPC下降順序對于DMPS是明顯的，但在VSFG結果中則不太明顯。其次，DPPC中觀察到的從1:1到2:1脂質/鈣復合物的轉變對于DMPS來說并不明顯，盡管ACa2+在熒光和VSFG數據中都出現。第三，雖然鈉離子在高壓（π>25 mN/m）下誘導兩種脂質紊亂，但這種效應對DMP顯著更大。目前，我們對這些觀察結果沒有一個令人滿意的解釋，除了差異必須源于集團結構的差異。

 盡管DPPC和DMPS之間離子脂質相互作用的一些細節存在這些差異，但很明顯，Ca2+在低表面壓力下誘導兩種脂質中有序結構域的形成，在中等表面壓力下誘導無序結構域的形成（對于DPPC），在最高表面壓力下誘導高度有序結構域的形成。對于這兩種脂質，觀察到明顯的證據表明脂質和Ca2+之間形成復合物，但Na+不存在。鈉對脂質單分子膜的影響要小得多，主要是在高表面壓力下引起紊亂（最明顯的是DMP）。在研究頭部附近水分子的方向時，觀察到兩種脂質之間的其他相似性。O-D拉伸振動中D2O亞相上DPPC和DMPS的VSFG光譜（未顯示數據）表明，水合水分子在陰離子和兩性離子頭基附近以相同的方式取向。這表明PC表現為陰離子脂質，因為DPPC的頭基與其膽堿基團朝向界面。32因此，鈣與PC和PS磷脂的相互作用類似并不奇怪，很可能與磷酸鹽部分協調。

結論

 綜上所述，我們結合三種互補技術來研究陽離子對PC和PS單分子膜的影響。我們的結果表明，鈉離子對DPPC單分子膜的影響很小，主要是擴張脂質單分子膜。另一方面，鈣有明顯的效果，這在很大程度上取決于表面壓力。在低表面壓力下，鈣離子誘導形成小而有序的脂質結構域，隨著表面壓力的增加，這些脂質結構域合并成更大的脂質結構域。在高表面壓力下，Ca2+對兩性離子脂質和陰離子脂質單層都產生“縮合效應”，表明離子優先與脂質頭基中的磷酸部分相互作用。在VSFG和表面張力測量中，Ca2+與脂質結合的分子特征從水和Ca溶液上的單分子膜之間的信號變化中可以明顯看出，對應于4?2/脂的面積變化，精確地說是Ca2+離子的表面積。

確認

 這項工作是“材料粘貼voor Fundamenteel Onderzoek（FOM）”研究項目的一部分，該項目由“荷蘭voor Wetenschapelijk Onderzoek（NWO）”組織資助。我們感謝本特·卡塞莫（BengtKasemo）建議進行這項實驗，并感謝克里斯蒂安·蒂舍爾（Christischer）和拉杰什·皮萊（RajeshPillai）對熒光顯微鏡的幫助。

 可用支持信息：實驗部分，DMPS單分子膜的VSFG光譜，以及使用和頻生成的分子取向分析。此材料可通過以下網址免費獲取：//pubs.acs.org.