3.結果和討論

3.1.分層

 為了了解空氣/水表面乳清蛋白的存在和數量如何影響HFBII的表面流變性，第一步是觀察純體系和混合體系的鋪展層。觀察擴散層的主要優點是表面成分已知，假設幾乎所有應用于界面的蛋白質都會擴散并留在界面上。圖1顯示了純HFBII和純乳清蛋白及其混合物的表面壓力等溫線。正如之前的研究[8,24]所知，與乳清蛋白相比，HFBII使表面壓力急劇上升，其行為更像剛性顆粒，而乳清蛋白則表現出更柔軟、更像聚合物的行為。據推測，由于乳清蛋白在界面處的構象變化，即展開，以及其大分子量，表面壓力在較低的表面負荷下升高。然而，上升幅度遠小于HFBII，乳清蛋白達到的最大表面壓力也較低。關于混合層的等溫線，可以觀察到，對于低水平，曲線移動到稍大的表面積，曲線的形狀仍然讓人想起純WPI曲線。當混合物中HFBII的比例上升到1:1或更高時，曲線的陡度增加，表面壓力開始在較小的表面積處形成。另一個需要提及的重要事項是，對于純HFBII，由于HFBII層的2D相變和凝固[11]，應注意22 mN/m以上的表面壓力值，從而形成具有顯著屈服應力的強彈性表面，可維持局部吸附和變形梯度[25]。因此，高于該值時，表面壓力傳感器附近的局部表面變形可能不同于全球平均變形。宏觀上，這也表現在表面上形成褶皺，這也表明了不均勻的變形和應力分布，如下所述。

 圖1。純蛋白質系統WPI（右）和HFBII（左）以及口糧WPI:HFBII為10:1、3:1、1:1、1:3和1:10的混合系統的表面壓力等溫線。

 值得注意的是，對于純HFBII，П–A等溫線在連續的壓縮膨脹循環中不會發生變化，這再次表明HFBII不可撤銷地附著在界面上，幾乎沒有任何構象變化。對于純WPI和1:1混合物，П–A等溫線略微向較小區域移動，這表明由于WPI分子的構象變化、多層形成或如前所述，由于WPI的解吸，表面重排的可能性較小。

 為了便于比較，從圖1的數據中，使用表面壓力第一次上升的斜率（由第一次壓縮產生）和公式E=（?2）提取了表觀膨脹模量（E）??1）/ln（A1/A2）。曲線的斜率總是在表面壓力在15到25 mN/m之間波動的表面積范圍內確定的。圖2顯示了表觀模量作為混合比的函數，表示為HFBII分數fHFBII=cHFBII/（cHFBII+cWPI）。

 圖2。表觀模量作為擴散層HFBII分數的函數，以及槽屏障之間界面上褶皺斑塊的圖示。右邊是純HFBII層的一個褶皺斑的顯微鏡照片。

 從圖2中可以看出，HFBII分數高達0.5的混合層，WPI的存在似乎主導了П15至25 mN/m之間界面處的表面流變行為。僅觀察到表面模量略有增加，此外，觀察到界面完全光滑。從HFBII分數為0.75開始，行為開始顯示HFBII層的特性。基于表觀模量，從WPI主導行為到HFBII主導行為的轉變對應于褶皺斑塊的視覺觀察，這對于壓力高于22 mN/m的純HFBII層來說是典型的。最后，在純HFBII系統中，斑塊相互連接，并觀察到最高模量，表明已知的HFBII行為。從這些觀察結果可以清楚地看出，在較低的HFBII/WPI比率下，富HFBII的疇的表面分離，包圍著富WPI的2D相，隨著HFBII比率的增加，這些疇的大小增加，它們變得相互連接，因此在fHFBII=0.6左右時，表面變得以HFBII為主。

3.2.吸附層

 發泡系統的下一步是觀察吸附層。與擴散層相反，表面成分未知；只有蛋白質的體積比是已知的。此外，表面成分可能會隨時間而變化，因為除了界面上WPI可能發生的構象變化外，表面和本體之間的材料連續交換是可能的。

 圖3顯示了表面壓力隨時間的變化。第一次～100 s后，清潔表面后，屏障仍在膨脹（程序說明見第2.2.2節），而在實驗開始后100 s至1000 s之間，表面積保持恒定，以允許吸附層形成并平衡。從1000秒開始，界面被壓縮，因此表面壓力增加。與在擴展層中觀察到的情況類似（在一個周期內，時間和面積呈線性關系），純HFBII的表面壓力增加斜率遠高于純WPI。大約2500秒后，表面再次膨脹，導致表面壓力降低。同樣在混合系統中，表面壓力在1000 s后趨于平穩。應注意1000 s后平衡表面壓力的絕對值，因為在22 mN/m以上以HFBII為主的層的情況下，界面變得有彈性，在0秒清潔表面后，可能會出現皺紋，并且針重新進入表面。在清潔界面和針浸入界面之間，可能已經吸附了一些蛋白質（當使用吸附層時，與使用鋪展層相比，校準表面張力并不容易，因為吸附實驗并不像使用鋪展層那樣從清潔的純水界面開始）然而，吸附過程中的曲線形狀，壓縮和膨脹提供了有關吸附層功能的重要信息。從1000秒開始，第一次壓縮開始，在大約2500秒時，接口再次擴展。

 現在，讓我們討論擴散和吸附HFBII和WPI層之間的差異（見圖1和圖3）。擴散層和吸附層的吸附等溫線形狀大致相似。主要區別在于記錄開始時表面壓力較高。對于鋪展層，選擇施加蛋白質的量，使施加后的表面壓力在第一次壓縮前上升至約1 mN/m。在吸附的情況下，界面上蛋白質的數量，以及表面壓力取決于吸附速率。吸附速率取決于蛋白質在本體中的濃度及其表面活性。該濃度選擇得相當高（0.1 mg/ml），因此吸附在界面上的蛋白質量不會顯著影響整體蛋白質濃度。

 同樣在視覺觀察中（見圖5），觀察到了與傳播系統的相似性。照片是從朗繆爾槽中的吸附層和壓縮層拍攝的。觀察到，在HFBII分數為0.33及以上的吸附層中，會形成典型的HFBII褶皺，這與擴散層不同，在擴散層中，從fHFBII分數為0.75起觀察到褶皺（重要的是要記住，第一個是體積中的蛋白質比率，第二個是界面處的蛋白質比率）。另一個區別是，在吸附系統中，皺紋更多地出現在屏障處的彎月面上，而在擴散系統中，皺紋出現在均勻分布在槽區的斑塊中（見圖2）。

 圖5。在液體中不同疏水組分的朗繆爾槽上，HFBII/WPI混合溶液的吸附層照片：a:fHFBII=1，B:fHFBII=0.67，C:fHFBII=0.5，D:fHFBII=0.33。

 圖4給出了純系統和一個混合系統在幾個壓縮/膨脹循環期間的表面壓力等溫線。我們注意到，在該圖中，HFBII和WPI的表面積按擴展系統曲線中彎曲點的出現比例縮放（圖1）。已知這一點反映了表面中明顯的緊密堆積轉變[8]。第一次壓縮導致的表面壓力的初始上升可以轉化為表觀膨脹模量，類似于對鋪展層所做的，盡管蛋白質的總量可能會因吸附而變化，因此在這種情況下，吸附和表面積是不可互換的。由于表面壓力的絕對值是未知的，所以決定考慮在壓縮時表面壓力的第一個10 Mn/m的上升來計算模量。圖7（上圖）給出了表觀模量與本體溶液中HFBII分數的函數關系。從圖中可以看出，從HFBII分數為0.33或以上的情況來看，吸附層以HFBII為主。這與皺紋的出現是一致的（圖5）。

 圖4。?/A-純HFBII、純WPI及其1:10混合物的吸附系統的等溫線，所有這些系統的總蛋白質濃度均為0.1 mg/ml。等溫線包括第一個壓縮/膨脹循環和5個滯后環。將HFBII和WPI的表面積縮放至攤鋪系統曲線中彎曲點的出現，對應于表面的明顯緊密堆積過渡（圖1）。

 有趣的是，將吸附層（圖7，頂部）的過渡點與HFBII占主導地位的行為進行比較，前者大致介于HFBII（整體）0.2和0.3（圖6）之間，后者大致位于0.6（表面）的擴散層（圖2）之間。假設這種情況發生在大致相同的表面成分上，這將表明0.2 HFBII:WPI本體成分對應于界面處的0.6 HFBII:WPI，毫不奇怪地證實HFBII比WPI更具表面活性。當然，應該注意的是，吸附實驗中存在的HFBII的絕對量高于擴散實驗中的HFBII絕對量，并且由于來自塊體的額外蛋白質吸附，界面處的比率可能會隨著壓縮/膨脹循環而改變，如下文所述，可能會形成多層。

圖6。表觀模量E是WPI和HFBII混合溶液中吸附層HFBII分數的函數。

 當仔細觀察混合吸附層（圖4）的表面壓力等溫線時，很明顯，?/a曲線隨著每個壓縮循環向左移動（面積較小），而純蛋白質的曲線在第一次膨脹/壓縮循環后幾乎沒有變化，在第一次膨脹/壓縮循環中，各層或多或少處于平衡狀態。純體系的行為可以用這樣一個事實來解釋：蛋白質實際上是不可逆地吸附在界面上的（從鋪展層的實驗中也可以清楚地看到）。在膨脹的前幾個循環中，更多的蛋白質可以吸附在自由表面，直到在最大膨脹點達到“平衡”。當系統被壓縮時，由于蛋白質不能解吸，各層被簡單地壓縮（對于WPI而言，部分表面展開），并且可能形成一種結構，WPII不能完全從界面解吸，而是垂直重新排列，并在富含HFBII的層下方形成第二層。這一假設用圖7中的圖表和下面的討論加以說明。在接下來的膨脹周期中，一些新的蛋白質可以繼續吸附，但由于現在表面濃度已經高于平衡體積濃度，沒有新的蛋白質會被吸附。此外，表面下第二層和靠近開放區域的WPI可以“翻轉”并填充膨脹間隙，比任何新的蛋白質從塊體中吸附的速度都快。這樣，就達到了一種穩定狀態。

 圖7。重復壓縮和膨脹后HFBII:WPI混合層結構形成示意圖。請注意，乳清蛋白的主要成分BLG僅在此處顯示。壓縮：BLG的一部分從表面排出，形成一個子層。膨脹：BLG的一部分停留在亞表層，而另一部分可能重新吸附到主層。頂面存在HFBII的凈濃度。

 吸附混合系統的行為非常有趣，值得進一步討論。?/A等溫線向左移動的事實表明，在逐漸膨脹和壓縮后，該層變得越來越緊密，接近純HFBII的表面覆蓋。這似乎得到了以下事實的支持：壓縮后的坡度增加，并且越來越接近HFBII的坡度，這再次表明層行為逐漸由HFBII主導。對此幾乎沒有可能的解釋：（i）WPI在界面上的構象變化（HFBII更為剛性），這在純體系中是不存在的，但當兩種蛋白質混合時會以某種方式出現。然而，這是不可能的，否則我們也會在擴散層中看到它的跡象；（ii）界面處的拓撲重排，最初界面是2D WPI連續的，WPI占主導地位，有一些分散的HFBII 2D域。這些域將在壓縮和擴展后逐漸互連，并形成HFBII連續網絡（在2D中，雙連續階段在拓撲上是不可能的）。如果這種情況再次發生，我們希望在擴散層中看到類似的趨勢，但事實并非如此（或在非常有限的程度上）；（iii）由于WPI在界面上的吸附/解吸，界面中蛋白質的組成發生變化，這同樣不太可能，因為兩種蛋白質的吸附能都很高，最后（iv）在界面上形成多層結構，其中頂層富含HFBII并占主導地位，而底層富含WPI并吸附到頂層。后者可能是因為即使HFBII分子的親水部分仍然含有大量疏水氨基酸，因此也是相對疏水的，并且由于HFBII和WPI下面的靜電斥力預計非常低，因為HFBII表面層的等電點接近中性，這是這些系統中的相關pH值[10]。如果為真，這將給出系統的中間配置狀態，介于WPI在界面處完全吸附和完全解吸之間，具有非常高的能量差。我們還看到混合鋪展層（見圖1）情況下的這種行為相似，但這與體相中沒有WPI的情況不太明顯。

3.3.泡沫實驗環境和壓力循環

 在前幾段中，我們考慮了HFBII和WPI在空氣/水界面的擴散和吸附層。在本節中，我們試圖將蛋白質在界面上的行為與泡沫的形成和穩定性聯系起來。在這里，當我們根據初始氣泡尺寸來描述泡沫性時，應該注意，初始氣泡尺寸取決于泡沫性和泡沫穩定性（形成后立即），因為在測量初始氣泡尺寸之前，泡沫與0.5%黃原膠溶液混合。黃原膠為系統提供了微弱的表觀屈服應力，足以阻止奶油化和氣泡再發酵，因此我們只能研究隨后的粗化過程[8]。

 圖8給出了以與圖3相同的HFBII:WPI比率制備的兩種泡沫的初始氣泡尺寸。最重要的觀察結果是，少量HFBII（來自fHFBII 0.03）在很大程度上影響泡沫的初始氣泡尺寸。此外，似乎從WPI主導向HFBII主導的行為轉變發生在fHFBII～=0.2，對應于朗繆爾槽中吸附層中觀察到的轉變（圖6）。

 圖3。吸附0.1 mg/ml HFBII和WPI期間的表面壓力與時間的函數關系；包括第一次壓縮/膨脹循環（左）和壓縮和膨脹期間吸附的HFBII和WPI層的表面壓力等溫線。

 圖8。根據濁度掃描測量評估的環境充氣泡沫和壓力循環泡沫的初始氣泡尺寸（用0.5%黃原膠稀釋后）。

 這表明，與鋪展層相比，泡沫中的成分功能性更好地對應于吸附層，這是有道理的，因為在泡沫形成期間，蛋白質層是通過吸附而不是在氣泡表面鋪展形成的，當氣泡通過攪拌器攪拌附近的高剪切區時，蛋白質層也會膨脹和收縮。最后的觀察結果是，當空氣/水界面以HFBII為主時，壓力循環樣品的初始氣泡尺寸似乎比未進行壓力循環的樣品小。

 氣泡尺寸隨時間的相對增加如圖9所示，表示為d2（t）/d2（0）。考慮到環境充氣樣品的泡沫穩定性，對于純HFBII系統，在本實驗期間未發現平均氣泡尺寸的顯著變化，表明幾乎不可能發生任何歧化。在純WPI的情況下，可以發現氣泡尺寸急劇增加，表明對歧化的穩定性較差。在混合情況下，隨著fHFBII的增加，我們可以看到氣泡尺寸穩定性增加的趨勢。我們可以粗略地說，當fHFBII<0.2時，氣泡大小的初始演化在很大程度上取決于WPI。然而，當fHFBII>0.2時，HFBII的存在控制泡沫穩定性。這與在朗繆爾槽中觀察到的初始氣泡大小和吸附層的趨勢非常一致。

圖9。使用TurbirScan根據氣泡尺寸演變評估泡沫穩定性

 對于0.03<fHFBII<0.2的泡沫中氣泡尺寸的增加，觀察到在初始粗化數小時后，曲線趨于平穩。在粗化過程中，小氣泡的收縮和總氣泡中較大氣泡的增長導致泡沫總表面積的凈減少。上述結果表明，氣泡穩定性隨著表面積的逐漸減小而增加，這與朗繆爾槽上吸附系統在大變形壓縮/膨脹循環中觀察到的行為一致。

4.結論

 在朗繆爾槽上研究了空氣/水界面上分散和吸附的WPI/HFBII層，其性質與泡沫的形成和穩定性有關。在擴散和吸附系統中，觀察到模量隨著表面或亞相中HFBII的分數逐漸增加，我們可以確定WPI主導行為和HFBII主導行為的區域。通過對混合表層皺紋的目視觀察，進一步證實了HFBII的優勢。

 當比較擴散和吸附系統時，發現需要更高的HFBII分數才能在擴散層中獲得HFBII主導行為，而不是吸附層（fHFBII分別為0.6和0.2）。此外，我們的結果表明，與擴散層相比，在連續的大規模壓縮/膨脹循環中，吸附層中蛋白質的組成會發生變化。我們解釋了擴散層和吸附層之間的差異，可能在界面處形成雙層/多層，頂層較硬，主要由HFBII控制，底層較軟，主要由WPI控制。這兩層的作用類似于平行連接的粘彈性膜，整體表面性質由較強的富HFBII層控制。從真實泡沫的初始氣泡尺寸及其抗粗化的長期穩定性數據來看，泡沫行為與吸附層中測量的表面膨脹特性密切相關。最后，我們觀察到，在HFBII和WPI的混合體系中，粗化過程隨著時間的推移逐漸趨于平穩，這進一步支持了我們關于氣泡表面多層形成的假設。

致謝

 作者衷心感謝Jeoffrey Jansen先生對Turbuscan實驗的幫助。荷蘭聯合利華研發部的魯本·阿諾多夫博士和英國科爾沃思聯合利華研發部的安德魯·考克斯博士因激發討論而受到認可。這項工作由荷蘭聯合利華研發中心弗拉丁根提供資金和執行。