一、微流控與微流控芯片

 微流控（Microfluidics）的含義是微尺度下的流體控制，其研究對象是使用微米級通道操控納升級以下微量液體的系統[1-3]。鑒于芯片是實現微流體控制的主要平臺，因而微流控芯片（Microfluidic chip）是微流控的主要研究內容。

 微流控芯片的制作主要依托于MEMS（Micro-Electro-Mechanical System）加工工藝，具有在微米尺度級別實現微量流體操控的能力。微流控芯片技術的特點來自于兩個方面：一是微流體的特性微尺度下流體的一系列特殊效應包括層流效應、表面張力及毛細效應、快速熱傳導效應和擴散效應等，這些效應有利于精確流體控制和實現快速反應；二是微加工工藝帶來的結構復雜性微加工工藝具有加工小尺寸、高密度微結構的能力，便于實現各種操作單元的靈活組合與規模集成。因此，樣品前處理、分離與分析、檢測等實驗流程得以在同一芯片上集成化和并行化，從而達到微型化、自動化、低消耗和高效率的目的[4,5]。

 微流控研究起始于20世紀90年代，至今已經有二十余年的發展歷史，其間經歷了基礎理論奠定、單元操作技術發展、小規模集成和大規模集成幾個歷史發展階段。至今，微流控技術已經較為成熟，已經在多個領域得到認可并廣為利用,其產業化趨勢亦是愈發明顯[6]。2003年《福布斯》雜志把這項技術評為“影響人類未來15件最重要發明之一”；2004年，美國Business 2.0雜志封面文章將微流控芯片列為“改變世界”的七種技術之一；2006年Nature雜志出版了一期微流控專輯，題名為“本世紀的技術”。

二、微流控體外診斷技術的優勢

 體外診斷（In vitro diagnosis,IVD），是指對人體的體液和組織等進行檢測而獲得臨床診斷信息。微流控芯片是體外診斷的有利技術平臺[7,8]，這表現在以下幾個方面：1.應用場景拓展傳統的檢驗設備多為大型儀器，雖然在測試通量和穩定性上具有優勢，但其使用局限于專業實驗室。微流控芯片系統體積小巧、操作簡單，完全可以在門急診、基層醫療單位甚至床邊進行檢測，這極大地拓展了體外診斷的應用空間；2.分析效率的提高集成化和并行化設計的微流控芯片系統，有能力在短時間內提供更為豐富的診斷信息，因而顯著提升了分析效率；3.測試成本的下降微流控芯片使用微反應體系，能夠大幅降低試樣消耗從而降低測試成本[9]。概括來講，微流控體外診斷技術的優勢可以歸結為多、快、好、省四個字，這種分析技術無疑是對現有體外診斷技術的巨大提升。

 微流控體外診斷技術已經引起了國家層面的重視。2016年國務院“十三五”國家科技創新規劃中關于體外診斷產品的章節寫到“突破微流控芯片等關鍵技術，開發全自動核酸檢測系統等一批重大產品，研發一批重大疾病早期診斷和精確治療診斷試劑以及適合基層醫療機構的高精度診斷產品，提升我國體外診斷產業競爭力”。由此可見，微流控體外診斷技術的發展已經上升到國家戰略層面。

 作者所在研究團隊工作于臨床檢驗第一線，課題組的研究方向是針對臨床檢驗中的痛點問題發展創新微流控診斷技術。經歷了十余年的研究歷程，課題組對于微流控體外診斷技術在臨床檢驗醫學中的應用價值逐步加深了理解。本文中就課題組對于微流控技術的理解以及我們的一些體外診斷應用嘗試與大家分享，希望能夠對檢驗醫學同仁有所幫助。

三、微流控芯片技術在體外診斷領域的應用嘗試

 當前，傳統的體外診斷技術已經極為成熟。微流控體外診斷產品若要進入體外診斷市場，勢必要展示出高人一籌的能力。相比較傳統的宏觀檢驗設備，微流控產品最大的市場拓展潛力在于：1.針對傳統產品無法適用的應用環境開發產品；2.發展性能指標和操作便利性具有明顯優勢的顛覆性新產品。一個成功的微流控體外診斷產品，需要在操作便利性、分析速度、分析通量和測試成本等幾個方面達到平衡。以下，我們就課題組在幾個關鍵的臨床檢驗應用領域的研究工作加以介紹。

（一）分子診斷

 分子診斷是新興的檢驗醫學領域。隨著熒光定量PCR的推廣，基因檢測技術在臨床醫學中得到了廣泛應用。盡管如此，現有核酸分析平臺的一些不足之處還是限制了分子診斷技術的推廣：1）場地要求嚴格，試劑準備、核酸提取和擴增需要分別在獨立房間內進行，極大限制了該技術在醫療資源有限條件下的開展；2）采用離線式分析，操作復雜、分析周期較長，不利于應對突發性事件；3）現有的熒光定量PCR方法多是針對單一指標檢測設計，對于多重基因檢測無論是操作繁瑣程度還是測試成本均是難以接受的。

 分子診斷是微流控芯片技術最具有代表性的應用領域。對于分子診斷應用，微流控芯片最大的貢獻在于該技術有潛力將核酸提取、擴增和檢測集成于同一裝置，因而可擺脫繁瑣操作以及對專業實驗室的依賴。此外，由于反應過程處于封閉的環境中，可以消除交叉污染的可能性。除了功能集成，微流控核酸分析芯片還需要具有一定的分析通量以滿足臨床實際需求。已經商業化的微流控分子診斷產品基本都是針對病原微生物檢測應用，其價值在于：1.實現現場快速檢測；2.解決難于培養鑒定病原（如結核桿菌、病毒、支原體等）鑒定問題。

 作者課題組最近發展一種液滴陣列微流控芯片核酸分析系統[10]。這種便攜式系統包含機械、磁力和光學檢測單元，其設計理念是平衡集成、通量、成本及便攜性等關鍵因素，發展適合于現場應用的病原篩查工具。系統所用微流控芯片上設計有多組以狹縫通道連通的串聯微池，全部分析試劑均以油包水形式預存儲于其中。由于表面張力效應，油相可以浸潤微池和狹縫而水相不能。利用磁鐵陣列驅動磁珠在串聯液滴中穿行，程序化完成細胞裂解-核酸結合、磁珠洗滌、核酸洗脫、擴增/檢測等一系列步驟，從而實現自動化和平行化核酸分析。該系統極為緊湊，適合于現場快速檢測及醫院門急診場景下的“隨到隨檢、快速響應”需求。課題組將這一系統用于性傳播疾病病原篩查，淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、解脲脲原體、生殖支原體等四種病原的篩查可在45 min內完成。

圖1液滴陣列微流控芯片核酸分析系統。A.分析儀器實物及結構示意圖;B.分析原理示意圖。

（二）免疫檢測

 免疫檢測是臨床檢驗極為重要的領域。目前，臨床免疫檢測的主流技術是化學發光和免疫比濁法，具有靈敏度高和檢測線性范圍寬的優勢。這些檢測方法一般使用大型儀器，分析通量較高。但是，由于購置成本和儀器體積因素，這類設備僅適合于大型實驗室使用。基于試紙條的膠體金法是快速免疫檢測的主流技術，該技術雖然使用方便，但在靈敏度和線性范圍方面受限。因此，臨床檢驗工作需要一種兼具操作便利性、檢測靈敏度和定量準確性的免疫檢測平臺，這對于急診以及基層醫療單位尤其重要。

圖2液滴陣列微流控芯片免疫分析系統。A.分析儀器結構示意圖;B.分析原理示意圖。

 作者課題組發展了一種微流控芯片免疫化學發光分析系統[10]。與前面介紹的液滴陣列微流控芯片核酸分析系統類似，免疫化學發光分析系統采用具有平行串聯微池結構的微流控芯片。免疫化學發光分析相關的一組試劑以油包水液滴形式預存儲于指定微池中。由于表面張力效應，狹縫可以隔絕水相溶液。通過程序化的磁力操控，在液滴間轉移磁珠，從而將化學發光免疫分析涉及的一系列操作，包括抗原-抗體結合、磁珠洗滌、酶促發光及信號檢測，在芯片分析系統內自動完成。研究利用發展的微流控化學發光免疫分析方法，進行了C反應蛋白(CRP)與降鈣素原(PCT)兩種感染性疾病標記物的同步檢測。在優化的實驗條件下，整個過程可在15 min內完成。CRP與PCT檢測限分別為0.31 ng?mL-1和0.09 ng?mL-1，標準曲線線性范圍分別為0.8-200 ng?mL-1和0.5-60 ng?mL-1，對照測試提示微流控芯片系統與商品化儀器檢測結果高度一致。

（三）病原微生物檢測

 病原微生物檢測主要包括病原鑒定和藥物敏感性判定兩個方面。目前，臨床微生物檢測面臨的最大問題就是檢測周期過長。感染性疾病大多病情兇險，需要及時診斷和治療，留給病原檢測的時間窗口只有30分鐘左右。然而，目前的病原微生物鑒定和藥物敏感性判定的典型周期是2-3天，這顯然難以滿足臨床需求。病原檢測技術的限制所帶來的結果是，一方面經驗性診斷的準確性難于保證，另一方面抗生素濫用引發了嚴重的耐藥問題。

 微流控技術對于病原微生物鑒定的解決方案多是采用核酸檢測策略，這在前面部分已經敘述。鑒于藥物敏感性(Antimicrobial Susceptibility Testing,AST)判定的實質是病原在藥物暴露條件下的增殖情況判定，微流控技術采用的策略是：1.通過培養器體積的減小，實現檢測信號的相對富集；2.使用更為精準的病原定量技術。這兩種策略均可以通過縮短病原培養時間實現快速的藥物敏感性判定。遵循這種理念，作者課題組發展了一種基于液滴陣列微流控芯片的數字化抗生素敏感性測試方法[11]。我們的設想是借助于數字化分析的精準定量能力顯著縮短細菌培養時間。細菌懸液與抗生素孵育后引入微流控芯片完成液滴發生和捕獲，生成高密度微液滴陣列。通過對液滴陣列進行熒光掃描成像，檢測每個液滴中的熒光信號并以此計算出細菌存活率（v）和陽性微液滴比例（p）。根據陽性微液滴比例，可以泊松分布算法推算出細菌密度,依據細菌密度變化可確定最小抑菌濃度（minimuminhibitory concentration,MIC）。我們的初步研究結果顯示應用該方法僅需30 min抗生素暴露時間即可判定大腸桿菌的抗生素敏感性。

 圖3A.液滴微流控芯片原理設計圖結構包含上游的液滴生成區和下游的液滴捕獲區；B.利用液滴熒光成像分辨細菌陽性和陰性液滴；C.液滴數字化分析顯示健康人和尿路感染病人尿液細菌計數差別；D.液滴數字化分析顯示敏感和耐藥細菌對于抗生素的反應。

（四）細胞水平抗腫瘤藥物敏感性測試

 體外抗腫瘤藥物敏感性測試是指導抗腫瘤藥物合理使用的有效手段。雖然基因檢測可以用來預測抗腫瘤藥物敏感性，然而該方法存在一定的不確定性。相比之下，細胞水平的藥物測試仍然是判定抗腫瘤藥物敏感性更為直接可靠的手段。然而，由于細胞水平抗腫瘤藥物敏感性測試存在體內外實驗結果差異大、測試通量有限以及操作難于標準化等問題，至今在臨床難以推廣。

 針對該問題，課題組開發了一套微流控腫瘤微陣列藥物測試系統[12]，其核心是一種復合式結構開放式微流控芯片。芯片頂層是開放式儲液池，底層是細胞培養池陣列，中間層是納米孔薄膜。利用納米孔薄膜不允許液體通過只允許跨膜擴散的特性，將其用做止流閥實現細胞懸液自動分配以及用作擴散屏障仿真血管內皮層。配合移液工作站，這種微流控芯片可以實現藥物篩選所包含的長期細胞培養、換液、多藥物處理以及細胞存活檢測等一系列操作步驟。

 研究利用自行設計加工的1010微流控細胞培養陣列芯片，實現了細胞培養陣列構建、長期細胞培養、換液、多藥物處理以及細胞存活檢測等一系列功能。乳腺癌細胞在持續培養3天后增殖形成了類組織結構。利用開放式微流控組織陣列芯片實現了3因素3水平正交藥物組合測試，并依據細胞存活率檢測結果篩選出最佳的抗乳腺癌藥物組合。研究結果顯示這種明微流控芯片能夠以高度仿真的組織實現多藥組合測試，因而有潛力成為指導腫瘤個體化精準治療的有力工具。

 圖4A.微流控腫瘤微陣列藥物測試系統包含一種復合式結構開放式微流控芯片以及移液工作站；B.微流控芯片上腫瘤微環境重建的示意圖。3D培養腫瘤細胞模擬腫瘤實質，水凝膠模擬支持和滋養腫瘤細胞的腫瘤基質，納米孔薄膜擴散屏障模擬血管內皮層；C.微流控芯片上連續三天內MCF-7乳腺癌細胞增殖情況。（Calcein-AM/EthD-1染色，比例尺：200μm）；D.抗腫瘤藥物正交組合測試結果。藥物測試包括LO2肝細胞和MCF-7乳腺癌細胞對A.阿霉素，B.紫杉醇和C.順鉑的3因素3水平正交組合藥物的反應。

 通過上述應用實例，我們將微流控體外診斷技術的優勢概括為：1.應用場景的拓展；2.分析效率的提高；3.分析時間的縮短以及4.檢測精度的提升。由此可見，微流控芯片是極具優勢的體外診斷技術平臺。

四、微流控體外診斷技術的機遇與挑戰

 目前，我國正處于巨大的社會變革過程，一方面國力的增強和科技的進步促進了新技術的發展和推廣，另一方面新形勢對于體外診斷行業提出了新的要求。體外診斷作為一個高附加值行業，將會在未來相當長的階段中快速發展，甚至成為國家的支柱產業。隨著醫療改革的推進，三級醫療體系將逐漸完善，隨之而來的是醫療資源由集中轉變變為分散模式。公立醫院的改革以及第三方檢驗機構的興起，勢必會對體外診斷技術提出更高的要求。在這種形勢下，微流控技術將會對體外診斷行業的發展提供一個有利的契機。

 現實中的微流控技術產業進程仍然是步履艱難。從技術角度來看，微流控體外診斷產品開發涉及多個學科領域，包括醫學、生物、化學和工程等。任何一個企業，想要建立這樣一個規模的研發隊伍都絕非易事。作為微流控系統的核心，微流控芯片的設計、材料選擇、表面處理、芯片加工乃至包裝保存，都具有一定技術難度。因此，微流控產品的研發難度遠遠高于傳統體外診斷產品。從產業環境角度來看，研究、生產和應用單位的脫節，高端加工技術的欠缺都增加了微流控產品開發的難度。此外，近期實體經濟的低迷也導至企業對于這種高技術含量產品研發信心不足。對于微流控體外診斷產品開發，我們認為以下幾個方面需要關注：首先是明確的市場定位，相比較傳統技術，微流控產品必須在某個應用領域或應用場景下具有突出的優勢；其次是前期研究基礎。由于微流控產品研發技術門檻較高，缺少扎實的研究基礎會增加開發進程的不確定性；再者就是盡量規避技術制約。由于各種條件限制，某些類型芯片可能在一定階段內不具備量產可行性。因此，我們對于微流控診斷產品開發的建議是：1.選擇恰當的應用對象；2.整合研發資源；3.開拓創造性的產學研合作模式。

五、結語

 總體看來，微流控體外診斷技術的發展前途是光明的，道路是曲折的。無論如何，我們堅信微流控技術是新形勢下應對臨床檢驗醫學挑戰的有力工具，該技術勢必會對臨床檢驗能力的提升起到巨大的推動作用。

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