3、結果

3.1.精漿的界面性質

精漿SDS-PAGE電泳顯示存在一(yi)系(xi)列不同比(bi)例的(de)(de)14至120 kDa的(de)(de)多肽（圖1），與先(xian)前(qian)的(de)(de)研究結(jie)果一(yi)致[37]。在車道4上估(gu)計了14至30 kDa之間的(de)(de)五個主要波段的(de)(de)比(bi)例。

圖1。從牛射精中(zhong)分離(li)并以不同濃度沉積(ji)的精漿(jiang)SDS-PAGE凝膠：lane 1:1g；車(che)道(dao)2:2g；車(che)道(dao)3:5g和車(che)道(dao)4:10g。

在(zai)大約(yue)16–17 kDa（74%強度）處(chu)發(fa)現(xian)了(le)兩條(tiao)(tiao)非常緊(jin)密和強烈的(de)條(tiao)(tiao)帶(dai)。它們被歸因于BSP1和BSP3[12]。在(zai)大約(yue)28 kDa（9%）處(chu)檢測(ce)到第二條(tiao)(tiao)帶(dai)，對(dui)應于BSP5[12]。BSP1、BSP3和BSP5代表精(jing)漿(jiang)中(zhong)所含最(zui)小多肽的(de)83%（在(zai)整個(ge)提取物中(zhong)約(yue)占65%）[17]。另(ling)一條(tiao)(tiao)帶(dai)在(zai)22kDa（4%）處(chu)檢測(ce)到，另(ling)一條(tiao)(tiao)帶(dai)在(zai)14kDa（13%）處(chu)檢測(ce)到，對(dui)應于核糖(tang)核酸酶[22]。

圖2。牛精漿溶(rong)液在(zai)空氣-水(shui)界面的表面張力(li)（±標準偏差），與提取物中(zhong)所含(han)蛋白(bai)質(zhi)的濃度有(you)關，并以對(dui)數(shu)標度表示（T=23.2?C±0.3?C、n=2，每個樣品(pin)重復4次）。

通過(guo)跟蹤精漿(jiang)水溶(rong)液（圖2）的(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)張力(li)與(yu)濃(nong)(nong)度(du)（吉(ji)布斯(si)膜(mo)(mo)(mo)(mo)）的(de)(de)(de)關系，突出(chu)了(le)組分。新樣(yang)品(pin)的(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)張力(li)相對(dui)較低（47 mN/m），并隨著(zhu)樣(yang)品(pin)的(de)(de)(de)稀(xi)(xi)釋(shi)(shi)而增加。在(zai)1/100000的(de)(de)(de)大(da)(da)稀(xi)(xi)釋(shi)(shi)后，表(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)張力(li)值等(deng)于純緩沖-空(kong)氣(qi)界面(mian)(mian)（72 mN/m）的(de)(de)(de)值。因此(ci)，精漿(jiang)顯(xian)(xian)示出(chu)顯(xian)(xian)著(zhu)的(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)活性：首先，新鮮(xian)樣(yang)品(pin)（47 mN/m）的(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)張力(li)與(yu)已知表(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)活性蛋(dan)白(bai)（如牛血清白(bai)蛋(dan)白(bai)[38]或(huo)溶(rong)菌酶[39]）的(de)(de)(de)值一樣(yang)低，其次，表(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)活性仍(reng)然存在(zai)于較大(da)(da)的(de)(de)(de)濃(nong)(nong)度(du)范(fan)圍內（需(xu)要稀(xi)(xi)釋(shi)(shi)100000以去除(chu)表(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)活性）。此(ci)外，通過(guo)朗(lang)繆爾薄(bo)膜(mo)(mo)(mo)(mo)分析(xi)了(le)空(kong)氣(qi)-緩沖界面(mian)(mian)處表(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)薄(bo)膜(mo)(mo)(mo)(mo)的(de)(de)(de)穩定(ding)性。薄(bo)膜(mo)(mo)(mo)(mo)（）的(de)(de)(de)壓縮等(deng)溫線顯(xian)(xian)示壓力(li)在(zai)兩個步驟中從0顯(xian)(xian)著(zhu)增加到35 mN/m。在(zai)18.9 mN/m時(shi)，出(chu)現斜率斷裂，這與(yu)空(kong)氣(qi)-緩沖界面(mian)(mian)分子構象(xiang)的(de)(de)(de)變化有(you)關。在(zai)較高(gao)(gao)壓力(li)下壓縮膜(mo)(mo)(mo)(mo)的(de)(de)(de)能力(li)（大(da)(da)約與(yu)生物膜(mo)(mo)(mo)(mo)相關的(de)(de)(de)壓力(li)，25 mN/m）表(biao)(biao)(biao)明，由(you)精漿(jiang)成分形成的(de)(de)(de)膜(mo)(mo)(mo)(mo)具有(you)較高(gao)(gao)的(de)(de)(de)穩定(ding)性。

通過(guo)(guo)傳播精漿(jiang)在(zai)空氣/緩(huan)沖(chong)液(ye)界面形成的單層的表面壓力面積(ji)（?–A）等溫線（n=3，標準(zhun)偏差(cha)在(zai)0-18.9 mN/m范圍內不超(chao)過(guo)(guo)1.5 mN/m，在(zai)18.9-38 mN/m范圍內不超(chao)過(guo)(guo)1.2 mN/m）。

3.2.低密度脂蛋白和脂質體對精子膜仿生外小葉的作用

將低密度脂(zhi)蛋(dan)白(bai)和脂(zhi)質體引(yin)入精子(zi)膜仿生外小葉亞(ya)期的(de)(de)影(ying)響如圖4所示。對(dui)于控制測量（未注(zhu)(zhu)入任何保(bao)護(hu)劑(ji)，設計為圖4中的(de)(de)M），表(biao)面積(ji)(ji)隨(sui)時間略微減小。當低密度脂(zhi)蛋(dan)白(bai)被注(zhu)(zhu)射到重建的(de)(de)外小葉下方的(de)(de)亞(ya)相（圖4中的(de)(de)曲(qu)線M/LDL）時，它導致表(biao)面積(ji)(ji)快速而大的(de)(de)增加。相反，與(yu)參考單層（曲(qu)線M）相比，脂(zhi)質體的(de)(de)注(zhu)(zhu)射（圖4中的(de)(de)曲(qu)線M/C4）幾乎沒(mei)有改變單層的(de)(de)膜壓力(li)。脂(zhi)質體與(yu)單層脂(zhi)質體的(de)(de)結合動力(li)學比低密度脂(zhi)蛋(dan)白(bai)慢得多。因此，在與(yu)精液制備相對(dui)應的(de)(de)時間尺度上，脂(zhi)質體在空氣(qi)-水界(jie)面上的(de)(de)吸附較弱(ruo)。

圖4。單層（M）所覆蓋的界面(mian)的相對表面(mian)積(ji)隨(sui)時間的變化，該(gai)單層（M）以25 mN/M的速度壓縮，并(bing)在(zai)不含任何額外分子(zi)（-）的緩沖(chong)液上形成，（…）LDL（4.6 mg PC）和(he)（-）脂質(zhi)體C4（含4.8 mg PC）。氣(qi)溫是34度?C在(zai)空氣(qi)-緩沖(chong)器接口處。

對于(yu)(yu)低(di)密度(du)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)白(bai)(bai)，根據低(di)密度(du)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)組(zu)成(cheng)(cheng)，注射(she)磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰膽(dan)堿的(de)(de)(de)(de)(de)量估計為4.6毫(hao)克[33]。就脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)體(ti)而(er)言，該分(fen)散(san)(san)(san)體(ti)含有(you)(you)6.55±0.02 mg脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)，即4.8 mg磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰膽(dan)堿。在(zai)重(zhong)建的(de)(de)(de)(de)(de)精子(zi)膜外(wai)小葉下(xia)注射(she)低(di)密度(du)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)白(bai)(bai)后，表面(mian)積的(de)(de)(de)(de)(de)大幅增加(jia)可(ke)能(neng)(neng)與(yu)低(di)密度(du)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)白(bai)(bai)在(zai)空氣-水界面(mian)自(zi)發吸附和(he)(he)(he)(he)擴散(san)(san)(san)的(de)(de)(de)(de)(de)能(neng)(neng)力有(you)(you)關[33]。低(di)密度(du)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)白(bai)(bai)在(zai)界面(mian)處的(de)(de)(de)(de)(de)容易破壞(huai)可(ke)能(neng)(neng)釋放出(chu)磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)和(he)(he)(he)(he)蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)，這些磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)和(he)(he)(he)(he)蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)是(shi)表面(mian)活(huo)性物質(zhi)(zhi)，而(er)甘油三酯是(shi)不(bu)可(ke)溶的(de)(de)(de)(de)(de)[33]。對于(yu)(yu)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)體(ti)，形(xing)(xing)成(cheng)(cheng)雙層(ceng)磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)和(he)(he)(he)(he)形(xing)(xing)成(cheng)(cheng)單(dan)層(ceng)磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)之(zhi)間的(de)(de)(de)(de)(de)平(ping)衡取(qu)決于(yu)(yu)鏈不(bu)飽(bao)(bao)和(he)(he)(he)(he)度(du)、鏈長和(he)(he)(he)(he)極性頭基(ji)[40]。考慮到(dao)雞蛋(dan)卵磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)（PC 74%）的(de)(de)(de)(de)(de)主要成(cheng)(cheng)分(fen)及其脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)肪酸組(zu)成(cheng)(cheng)[41]，飽(bao)(bao)和(he)(he)(he)(he)PC和(he)(he)(he)(he)不(bu)飽(bao)(bao)和(he)(he)(he)(he)PC的(de)(de)(de)(de)(de)比例分(fen)別約為48%和(he)(he)(he)(he)52%。在(zai)本研究的(de)(de)(de)(de)(de)溫度(du)下(xia)，飽(bao)(bao)和(he)(he)(he)(he)PC未熔(rong)化，可(ke)能(neng)(neng)不(bu)會在(zai)界面(mian)擴散(san)(san)(san)，而(er)不(bu)飽(bao)(bao)和(he)(he)(he)(he)PC遠(yuan)遠(yuan)超過(guo)其熔(rong)化溫度(du)，并可(ke)能(neng)(neng)擴散(san)(san)(san)。在(zai)剩余的(de)(de)(de)(de)(de)部(bu)分(fen)PE（11%）中，形(xing)(xing)成(cheng)(cheng)磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)雙層(ceng)和(he)(he)(he)(he)單(dan)層(ceng)之(zhi)間的(de)(de)(de)(de)(de)平(ping)衡與(yu)磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)結構密切相關，因此不(bu)能(neng)(neng)對它們給(gei)出(chu)任何結論。因此，沒有(you)(you)基(ji)本的(de)(de)(de)(de)(de)解釋。雞蛋(dan)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)體(ti)缺乏吸附可(ke)以解釋為其擴散(san)(san)(san)之(zhi)前已在(zai)自(zi)由界面(mian)上進行過(guo)檢查：界面(mian)上已經存在(zai)的(de)(de)(de)(de)(de)單(dan)層(ceng)可(ke)能(neng)(neng)會限(xian)制磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)基(ji)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)擴散(san)(san)(san)，而(er)磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)基(ji)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)體(ti)在(zai)其他地(di)方被認為是(shi)高(gao)穩定性的(de)(de)(de)(de)(de)散(san)(san)(san)裝物，尤其是(shi)由磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰膽(dan)堿組(zu)成(cheng)(cheng)時。

3.3.低密度脂蛋白和脂質體分離精漿成分

將(jiang)牛精漿(jiang)（SP）注(zhu)射到單(dan)層下方時，監測(ce)分子(zi)面(mian)(mian)積(ji)隨(sui)時間的(de)(de)變(bian)化（圖(tu)5中的(de)(de)曲線M/SP）。由于脂質(zhi)覆(fu)蓋了界面(mian)(mian)，表面(mian)(mian)積(ji)并沒(mei)有立即增加(jia)，而是(shi)在150s后(hou)才增加(jia)。它在150秒內達到最大值(zhi)（注(zhu)射后(hou)300秒），然后(hou)穩定(ding)300秒并隨(sui)時間緩慢下降(jiang)（圖(tu)5）。表面(mian)(mian)積(ji)的(de)(de)快速(su)(su)增加(jia)表明(ming)SP組分（很可能是(shi)蛋(dan)白質(zhi)）具有良好的(de)(de)表面(mian)(mian)活性(xing)，如圖(tu)所示。2和3。600秒后(hou)，比表面(mian)(mian)積(ji)的(de)(de)減小速(su)(su)度與純單(dan)分子(zi)膜相同。因此，BSP蛋(dan)白一旦被吸附，就會留在界面(mian)(mian)上。

圖(tu)5。注入（…）后，由(you)單層（M）覆(fu)蓋并(bing)在不含(han)（-）額外分子的緩沖(chong)(chong)液上形成的界面的相對表(biao)面積(ji)隨時間(jian)的變(bian)化(hua)SP（26.6±1.5 mg蛋(dan)白質(zhi)）、SP（26.6±1.5 mg蛋(dan)白質(zhi)）和不同濃(nong)度(du)（··-）C1、（·-）C2的脂(zhi)質(zhi)體的混合物(wu)，（·-）C3和（·-）C4（分別(bie)為1.17±0.02 mg、2.18±0.02 mg、4.37±0.02 mg和6.55±0.02 mg脂(zhi)質(zhi)）和（－－－）LDL（4.6 mg PC）和SP（26.6±1.5 mg蛋(dan)白質(zhi)）的混合物(wu)。氣溫是34度(du)?C在空氣-緩沖(chong)(chong)器(qi)接口處。表(biao)面壓力保持在25 mN/m。

當LDL與(yu)牛精漿(jiang)以(yi)重量(liang)(liang)-蛋(dan)(dan)白(bai)質比10:1（BSP:LDL）混合并注射到單(dan)層下方(fang)時，隨時間記(ji)錄的(de)(de)(de)單(dan)層分(fen)子面(mian)積(ji)幾乎沒有變(bian)化(hua)（曲(qu)線(xian)M/SP+LDL，圖5）。400秒左右(you)出現(xian)一(yi)個(ge)肩部，顯示BSP蛋(dan)(dan)白(bai)的(de)(de)(de)弱吸(xi)(xi)附(fu)（該肩部代表M/SP的(de)(de)(de)5%，上(shang)圖曲(qu)線(xian)）。然(ran)后，分(fen)子面(mian)積(ji)的(de)(de)(de)變(bian)化(hua)在(zai)1000秒后減小(xiao)并趨于穩定。其下降幅度不如M和M/SP曲(qu)線(xian)的(de)(de)(de)變(bian)化(hua)幅度大，表明LDL組分(fen)吸(xi)(xi)附(fu)，與(yu)它們(men)在(zai)界面(mian)上(shang)的(de)(de)(de)高擴(kuo)散能力一(yi)致（曲(qu)線(xian)M/LDL，圖4）。因此(ci)，由于低(di)密(mi)度脂(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)白(bai)（LDL），SP中BSP蛋(dan)(dan)白(bai)在(zai)界面(mian)上(shang)的(de)(de)(de)吸(xi)(xi)附(fu)大大減少，BSP/LDL的(de)(de)(de)比率非常接近(jin)最(zui)佳值，以(yi)完全防(fang)止BSP蛋(dan)(dan)白(bai)影響單(dan)層。根據(ju)低(di)密(mi)度脂(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)白(bai)的(de)(de)(de)組成，注射磷脂(zhi)(zhi)酰膽(dan)堿(jian)的(de)(de)(de)量(liang)(liang)估計為4.61毫克(ke)[33]。因此(ci)，向4.61 mg低(di)密(mi)度脂(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)白(bai)磷脂(zhi)(zhi)酰膽(dan)堿(jian)注射26.6 mg精漿(jiang)蛋(dan)(dan)白(bai)質，即(ji)0.17 mg磷脂(zhi)(zhi)酰膽(dan)堿(jian)注射1 mg精漿(jiang)蛋(dan)(dan)白(bai)質。

脂質(zhi)(zhi)(zhi)體（不(bu)同濃度）對BSP蛋白(bai)的(de)(de)作用(yong)也如圖5所示(shi)。脂質(zhi)(zhi)(zhi)體在進入亞階段前與精(jing)漿接觸(chu)。隨著脂質(zhi)(zhi)(zhi)體中(zhong)濃度的(de)(de)增(zeng)加（曲(qu)線M/SP+C1至(zhi)C4），BSP蛋白(bai)吸(xi)附引起的(de)(de)表面積增(zeng)加逐漸延遲(chi)并減少(shao)。當含量(liang)(liang)達(da)到(dao)4.37 mg（C3）時，界面上仍有少(shao)量(liang)(liang)BSP蛋白(bai)摻(chan)(chan)入，1600 s時出(chu)現肩部。在最高(gao)濃度（C4）下，未(wei)觀(guan)察(cha)到(dao)BSP蛋白(bai)摻(chan)(chan)入，分(fen)(fen)子面積的(de)(de)變化(hua)甚至(zhi)比(bi)對照曲(qu)線更(geng)負，表明膜組分(fen)(fen)在亞相(xiang)中(zhong)輕(qing)微溶解。因此，脂質(zhi)(zhi)(zhi)體作用(yong)于BSP蛋白(bai)的(de)(de)方式(shi)與LDL相(xiang)同。最有趣(qu)的(de)(de)比(bi)例似乎介于C3和(he)C4之(zhi)間(jian)。根據確定面積變化(hua)與脂質(zhi)(zhi)(zhi)體注射(she)磷脂質(zhi)(zhi)(zhi)量(liang)(liang)之(zhi)間(jian)相(xiang)互作用(yong)的(de)(de)曲(qu)線計算得出(chu)（圖6）。注射(she)26.6 mg BSP的(de)(de)最佳質(zhi)(zhi)(zhi)量(liang)(liang)為4.6 mg，即PC:BSP比(bi)為0.16（w/w）。

圖6。相對面積隨注射到亞相的脂質(zhi)體質(zhi)量的變化。線(xian)性回歸的R2為0.992。

3.4.脂質體對精漿作用的顯微評價

用透射電鏡（TEM）觀察脂(zhi)質體(ti)(ti)(ti)或(huo)LDL與(yu)含(han)有SP的(de)(de)(de)(de)(de)BSP蛋白的(de)(de)(de)(de)(de)混合(he)(he)物(wu)，并與(yu)對(dui)(dui)照組進(jin)行比(bi)較。無論(lun)放(fang)大倍數如何，與(yu)精漿(jiang)(jiang)相(xiang)(xiang)(xiang)對(dui)(dui)應的(de)(de)(de)(de)(de)圖(tu)(tu)(tu)像(xiang)(xiang)均未顯示任何結(jie)(jie)構（圖(tu)(tu)(tu)S1）。相(xiang)(xiang)(xiang)反，與(yu)LDL和脂(zhi)質體(ti)(ti)(ti)相(xiang)(xiang)(xiang)關的(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)(jie)構很容易(yi)通過（i）LDL的(de)(de)(de)(de)(de)致(zhi)密且(qie)相(xiang)(xiang)(xiang)當圓(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de)形(xing)狀(zhuang)（圖(tu)(tu)(tu)7A）和（ii）脂(zhi)質體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)圓(yuan)形(xing)且(qie)有時為多層(ceng)結(jie)(jie)構（圖(tu)(tu)(tu)7B）來識別。在(zai)存(cun)在(zai)精漿(jiang)(jiang)的(de)(de)(de)(de)(de)情(qing)況(kuang)下，對(dui)(dui)整套圖(tu)(tu)(tu)像(xiang)(xiang)的(de)(de)(de)(de)(de)分析仍(reng)然(ran)顯示出圓(yuan)形(xing)物(wu)體(ti)(ti)(ti)。它們的(de)(de)(de)(de)(de)大小(xiao)平均與(yu)未使用螯(ao)合(he)(he)劑(ji)分析的(de)(de)(de)(de)(de)大小(xiao)相(xiang)(xiang)(xiang)似（圖(tu)(tu)(tu)S2）。然(ran)而(er)，在(zai)SP存(cun)在(zai)的(de)(de)(de)(de)(de)幾個地方，觀察到一些大的(de)(de)(de)(de)(de)圓(yuan)形(xing)物(wu)體(ti)(ti)(ti)，其特征是（i）被(bei)厚層(ceng)（圖(tu)(tu)(tu)7C含(han)LDL）包(bao)圍的(de)(de)(de)(de)(de)天然(ran)狀(zhuang)結(jie)(jie)構，或(huo)（ii）環形(xing)內的(de)(de)(de)(de)(de)致(zhi)密核(he)心（圖(tu)(tu)(tu)7D含(han)脂(zhi)質體(ti)(ti)(ti)和圖(tu)(tu)(tu)S3）。與(yu)圖(tu)(tu)(tu)7B相(xiang)(xiang)(xiang)比(bi)，與(yu)精漿(jiang)(jiang)混合(he)(he)的(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)質體(ti)(ti)(ti)系統地呈(cheng)現出比(bi)天然(ran)脂(zhi)質體(ti)(ti)(ti)更致(zhi)密的(de)(de)(de)(de)(de)核(he)心。這些新結(jie)(jie)構可能是由于BSP蛋白滲(shen)透到界(jie)面(mian)層(ceng)而(er)導致(zhi)膜破(po)裂(lie)的(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)(jie)果，從而(er)導致(zhi)TEM對(dui)(dui)比(bi)度的(de)(de)(de)(de)(de)改變。

圖(tu)(tu)7。（A）低密度脂蛋(dan)(dan)白，（B）脂質體(ti)(ti)，（C）低密度脂蛋(dan)(dan)白和(he)精(jing)漿(jiang)(jiang)（精(jing)漿(jiang)(jiang)中的比(bi)例為0.17 mg PC/mg BSP蛋(dan)(dan)白質）和(he)（D）脂質體(ti)(ti)和(he)精(jing)漿(jiang)(jiang)（精(jing)漿(jiang)(jiang)中的比(bi)例為0.16 mg PC脂質體(ti)(ti)/mg BSP蛋(dan)(dan)白質）的冷凍電鏡(jing)圖(tu)(tu)像。

4、討論

4.1.BSP蛋白的表面性質及其可能的生物學作用

張(zhang)力測定結(jie)(jie)果顯示精漿中含有表面(mian)活性(xing)(xing)(xing)成(cheng)(cheng)分(fen)。這些(xie)(xie)很可能是蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)，因(yin)(yin)為它們構成(cheng)(cheng)精漿的(de)(de)主(zhu)要部分(fen)。它們由(you)幾個(ge)親水(shui)性(xing)(xing)(xing)和(he)疏(shu)水(shui)性(xing)(xing)(xing)域(yu)組(zu)成(cheng)(cheng)[5]，賦予它們兩親性(xing)(xing)(xing)。考慮到生物學(xue)背景，我們可以(yi)假設BSP蛋(dan)白(bai)能夠(gou)到達(da)磷脂(zhi)覆蓋的(de)(de)界面(mian)，這是由(you)于它們與(yu)PC的(de)(de)相互作(zuo)(zuo)用和(he)自身的(de)(de)表面(mian)活性(xing)(xing)(xing)。這可以(yi)解釋為什么這個(ge)過程很快[42]。將(jiang)肽或蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)插入(ru)磷脂(zhi)單分(fen)子膜通常(chang)在(zai)比凝聚(ju)域(yu)更(geng)可壓縮的(de)(de)流(liu)體(ti)(ti)域(yu)中進(jin)行(xing)[43]。34歲(sui)?C、流(liu)體(ti)(ti)域(yu)由(you)血漿鹵素和(he)不飽和(he)磷脂(zhi)酰膽(dan)堿組(zu)成(cheng)(cheng)[35]。因(yin)(yin)此(ci)，根據前面(mian)提到的(de)(de)涉及疏(shu)水(shui)腔(qiang)的(de)(de)機(ji)制，BSP蛋(dan)白(bai)可以(yi)很容易(yi)地穿透(tou)這些(xie)(xie)流(liu)體(ti)(ti)結(jie)(jie)構域(yu)，在(zai)這些(xie)(xie)流(liu)體(ti)(ti)結(jie)(jie)構域(yu)中它們可以(yi)立即與(yu)含有磷酸膽(dan)堿的(de)(de)分(fen)子相互作(zuo)(zuo)用[11,12,34,42,44–46]。吸附(fu)的(de)(de)BSP量可能受(shou)到流(liu)體(ti)(ti)域(yu)可壓縮性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)限(xian)制。綜上所述(shu)，BSP蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)一(yi)旦被吸附(fu)，由(you)于其表面(mian)性(xing)(xing)(xing)質(zhi)(zhi)(zhi)（我們的(de)(de)工作(zuo)(zuo)）、構象重排[47]以(yi)及它們與(yu)膜組(zu)件的(de)(de)強烈相互作(zuo)(zuo)用[48]，仍然固定在(zai)界面(mian)上。

4.2.脂質體和低密度脂蛋白在分離BSP蛋白中的作用

我們的(de)(de)(de)(de)(de)結果表(biao)明(ming)，只要使(shi)用合(he)(he)適的(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)/BSP比(bi)(bi)例(li)(li)，脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)就(jiu)可(ke)以像LDL一樣有(you)效地阻止BSP蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)到(dao)(dao)達(da)界面(mian)。對于低(di)密度(du)(du)脂(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)，我們的(de)(de)(de)(de)(de)模(mo)型顯示，低(di)溫保(bao)存中(zhong)常(chang)用的(de)(de)(de)(de)(de)BSP/LDL比(bi)(bi)率(lv)(lv)（10:1 w/w）非(fei)常(chang)接近最(zui)佳(jia)值(zhi)，以完全防(fang)止BSP蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)影響單(dan)層(ceng)(ceng)。低(di)密度(du)(du)脂(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)組織中(zhong)PC/BSP與(yu)PC的(de)(de)(de)(de)(de)比(bi)(bi)率(lv)(lv)為(wei)0.17 mg磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)酰(xian)膽堿，1 mg精漿蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)。同(tong)樣，脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)最(zui)佳(jia)比(bi)(bi)例(li)(li)PC/BSP為(wei)0.16 mg磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)酰(xian)膽堿和(he)(he)1 mg精漿蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)。知道卵子(zi)(zi)中(zhong)PC的(de)(de)(de)(de)(de)比(bi)(bi)例(li)(li)可(ke)能(neng)取決于喂食情(qing)況，不(bu)同(tong)批次的(de)(de)(de)(de)(de)LDL中(zhong)PC的(de)(de)(de)(de)(de)比(bi)(bi)例(li)(li)可(ke)能(neng)不(bu)同(tong)，因(yin)此(ci)這些比(bi)(bi)例(li)(li)被(bei)認(ren)為(wei)是(shi)相(xiang)等(deng)的(de)(de)(de)(de)(de)。該比(bi)(bi)率(lv)(lv)與(yu)LDL或(huo)(huo)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)隔(ge)離(li)結構(gou)無關的(de)(de)(de)(de)(de)事實(shi)表(biao)明(ming)，LDL中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)載脂(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)不(bu)與(yu)BSP結合(he)(he)，盡管這種結合(he)(he)是(shi)可(ke)能(neng)的(de)(de)(de)(de)(de)[26,49]。更(geng)引(yin)人注目的(de)(de)(de)(de)(de)是(shi)，這一結果表(biao)明(ming)PC作為(wei)LDL中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)單(dan)層(ceng)(ceng)或(huo)(huo)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)雙層(ceng)(ceng)組裝沒有(you)影響。在低(di)密度(du)(du)脂(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)情(qing)況下，磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)占(zhan)據外層(ceng)(ceng)單(dan)層(ceng)(ceng)，并(bing)且所(suo)有(you)這些磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)都可(ke)被(bei)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)接近。相(xiang)反，只有(you)形成單(dan)層(ceng)(ceng)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)雙層(ceng)(ceng)外小(xiao)葉的(de)(de)(de)(de)(de)磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)真正與(yu)BSP蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)直接接觸。由于脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)和(he)(he)低(di)密度(du)(du)脂(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)絡(luo)合(he)(he)比(bi)(bi)率(lv)(lv)相(xiang)同(tong)，并(bing)且PCP分子(zi)(zi)（74%）也(ye)構(gou)成雙層(ceng)(ceng)的(de)(de)(de)(de)(de)內小(xiao)葉，因(yin)此(ci)這些分子(zi)(zi)也(ye)參與(yu)BSP蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)絡(luo)合(he)(he)。與(yu)BSP蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)易于插入疏水膜(mo)相(xiang)一致，這些BSP蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)可(ke)向內小(xiao)葉遷移，并(bing)誘導脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)雙層(ceng)(ceng)破裂/融(rong)合(he)(he)，如TEM所(suo)觀察到(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)。然(ran)而(er)，樣品中(zhong)LDL和(he)(he)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)結構(gou)變化并(bing)不(bu)普遍(bian)，BSP蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)可(ke)以認(ren)為(wei)主要錨定在LDL和(he)(he)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)面(mian)。當脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)與(yu)BSP的(de)(de)(de)(de)(de)比(bi)(bi)例(li)(li)高于本文所(suo)研究(jiu)的(de)(de)(de)(de)(de)比(bi)(bi)例(li)(li)時，BSP1（BSP家族中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)主要蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)）誘導脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)小(xiao)泡的(de)(de)(de)(de)(de)伸長和(he)(he)珠(zhu)項(xiang)鏈(lian)狀(zhuang)結構(gou)的(de)(de)(de)(de)(de)形成，這些結構(gou)演變為(wei)小(xiao)泡或(huo)(huo)線(xian)狀(zhuang)結構(gou)[50]。

5、結論

首先，表(biao)(biao)面(mian)張力(li)(li)測量(liang)證明(ming)牛精漿(jiang)具有(you)(you)很好(hao)的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)面(mian)活性(xing)(xing)，可能(neng)(neng)與(yu)BSP蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)有(you)(you)關。其次，Langmuir膜(mo)法(fa)（先前被證明(ming)是公(gong)牛精子外(wai)細胞(bao)膜(mo)的(de)(de)(de)(de)(de)相(xiang)關脂(zhi)(zhi)質單層模型[35]）有(you)(you)助于表(biao)(biao)征BSP蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)對(dui)脂(zhi)(zhi)質膜(mo)的(de)(de)(de)(de)(de)親(qin)和(he)力(li)(li)。BSP蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)能(neng)(neng)夠到達被磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)覆蓋的(de)(de)(de)(de)(de)牛精子細胞(bao)表(biao)(biao)面(mian)，這得(de)益于它(ta)們(men)(men)與(yu)磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)酰膽堿的(de)(de)(de)(de)(de)相(xiang)互(hu)作(zuo)用(yong)和(he)自身的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)面(mian)活性(xing)(xing)。我(wo)們(men)(men)的(de)(de)(de)(de)(de)假設是，由(you)于它(ta)們(men)(men)自身的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)面(mian)活性(xing)(xing)，它(ta)們(men)(men)首先穿(chuan)透精子的(de)(de)(de)(de)(de)外(wai)小葉，然后(hou)由(you)于與(yu)磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)酰膽堿的(de)(de)(de)(de)(de)強(qiang)烈(lie)相(xiang)互(hu)作(zuo)用(yong)而留在(zai)那里。最(zui)后(hou)，利用(yong)Langmuir膜(mo)法(fa)對(dui)已知(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)BSP蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)螯合劑(ji)如ldl和(he)脂(zhi)(zhi)質體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)作(zuo)用(yong)進行了篩選。脂(zhi)(zhi)質體(ti)與(yu)低密度(du)(du)脂(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)一樣有(you)(you)效(xiao)地阻止BSP蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)插入磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)層。低密度(du)(du)脂(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)和(he)脂(zhi)(zhi)質體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)比(bi)例相(xiang)同(tong)：0.16–0.17 mg磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)酰膽堿/mg BSP。我(wo)們(men)(men)還不(bu)知(zhi)道在(zai)冷凍保存的(de)(de)(de)(de)(de)時間尺度(du)(du)上(shang)脂(zhi)(zhi)質體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)非常微(wei)弱的(de)(de)(de)(de)(de)插入是否有(you)(you)一些生物(wu)學(xue)后(hou)果。需要進一步(bu)研究分析每種(zhong)BSP蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)面(mian)性(xing)(xing)質及其在(zai)膜(mo)上(shang)的(de)(de)(de)(de)(de)作(zuo)用(yong)。此外(wai)，可以(yi)(yi)測試Langmuir膜(mo)，以(yi)(yi)檢測BSP與(yu)膜(mo)的(de)(de)(de)(de)(de)親(qin)和(he)力(li)(li)隨(sui)溫度(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)變化[20]。最(zui)后(hou)，Langmuir膜(mo)法(fa)是一種(zhong)有(you)(you)效(xiao)的(de)(de)(de)(de)(de)篩選BSP蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質新螯合劑(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)方法(fa)。該方法(fa)可適用(yong)于其他動物(wu)物(wu)種(zhong)。

致謝

作(zuo)者感謝IMV Technologies（法(fa)國）的財務支持，Gérard Chatagnon負(fu)(fu)責精漿蛋(dan)白質(zhi)定量，Véronique Solé負(fu)(fu)責凝膠(jiao)電泳，Maureen Collobert負(fu)(fu)責英語校正，Alain Sire和(he)Patrice Papineau負(fu)(fu)責手套(tao)箱的構思和(he)實現，允許在受控大氣中使(shi)用朗繆爾槽。