摘要

 我們報道了一項聯合振動和頻率產生（SFG）光譜、布魯斯特角顯微鏡（BAM）和橢偏儀研究不同表面活性劑在水中作為表面活性劑密度的函數。在朗繆爾槽中測量了表面活性劑在表面活性劑CH和水OH拉伸區的振動SFG光譜。在低密度下，表面活性劑存在時產生的SFG信號與清水中產生的SFG信號無法區分?空中接口。當表面活性劑密度增加時，即在壓縮單分子層時，觀察到CH和OH光譜區域的SFG信號突然增加。對于更高的激光通量，這種逐步增加發生在表面活性劑密度越來越高的情況下。由于BAM表明，表面活性劑分子在這些低密度下明顯存在，因此我們得出結論，在低表面活性劑密度下，激光束在液體膨脹相中將相對高密度的區域與表面活性劑置換出激光聚焦區域。這是由于在1 kHz的重復激光激發下，頂部為單層的水相局部加熱引起的熱梯度的結果。它可以通過使用旋轉槽繞過。通過這種方式，可以刷新采樣的表面積，從而可以將無偽影的振動SFG光譜測量到最低的表面活性劑密度。在橢偏儀實驗中，可以注意到一個類似的步驟，然而，這是一個不同的性質；i、例如，它與加熱無關（激光注量很低，光不共振），而是與分子躍遷有關。橢偏儀中每一分子面積的函數步驟的出現，關鍵取決于單層膜的制備。在制備單分子膜的過程中，通過給分子留出時間和空間使其松弛，也可以消除這一步驟。

介紹

 在過去的幾十年中，紅外-可見和頻發生（SFG）已被證明是研究水相表面活性劑的極好工具。1.?9在該技術中，紅外激光束與可見激光束在感興趣的界面處組合，并檢測兩者的和頻光束。在中心對稱介質中，信號的產生通常是被禁止的，因此對界面上分子的存在非常敏感。如果紅外激光與界面分子的振動躍遷共振，則SFG強度增強，從而可以測量界面分子的振動光譜。SFG光譜的形狀包含有關表面活性劑的分子構象和方向的信息。大多數研究都集中在高密度單分子膜上，盡管在低密度下有令人驚訝的觀察報告。我們中的一些人（Roke等人4）以前曾報告過C?H不溶性表面活性劑DPPC（1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿；見圖1）在水上的拉伸模式，密度約為100?2/分子，密度間隔小于1?2/分子，這歸因于脂質尾部的卷曲和未卷曲。最近，Chen等人9報告了DPPC在水和含有低二甲基亞砜摩爾分數的水上的CH信號在該密度附近的類似行為。此外，他們報告說，來自DPPC頭部總成的P=O振動信號僅在CH信號存在時出現。他們將CH信號的缺失/存在歸因于DPPC分子的無序/有序尾部。P=O信號的缺失可通過頭部大的取向分布來解釋。

 圖1。頂板：DPPC的分子結構。中間面板：裸露水面（底部光譜）和密度增加的水中DPPC的SSP極化SFG光譜。壓力（mN/m）和每個分子的面積（?2）分別從底部到頂部增加和減少，在圖表旁邊給出。每個分子的面積由氯仿溶液滴的數量控制。CH（2800）?3000厘米?1），氫鍵OH（3000?3600厘米?1），還有免費的哦(～3705厘米?1）拉伸振動可見。底部面板：從裸露水面的中間面板放大，每個分子的DPPC為108?2，以表明它們的相似性。插圖放大了裸露水面和DPPC（100?2）表面的自由OH拉伸振動區域。在每個分子的這個區域，壓力仍然低于檢測極限，表面上DPPC的存在顯然不影響自由OH拉伸振動的振幅。相對較高的紅外通量(～10 mJ/cm2）用于本實驗。

 雖然這些解釋與數據一致，但對于所有模式，脂質信號消失可能有些令人驚訝；即使對于脂質卷曲的高度無序的單層，對稱性也會被破壞，這僅僅是因為（可能是中心對稱的）脂質層兩側的水和空氣的介電常數不同。Roke et al.和Chen et al.都是基于C?H和P=O拉伸區域，即，源自脂質的模式。氫鍵水信號以前從未被研究過，它將使人們對觀察到的現象有更多的了解。人們可能會認為，如果密度發生變化，水信號也有助于理解脂質的組織。特別是，這個問題提出了水結構如何受到可能無序脂質的影響。水中氫鍵水的信號?如果存在表面活性劑，則空氣界面通常較大，其中水SFG信號的強度取決于表面活性劑的類型。10?12因此，在壓縮脂質層時，預計水帶中會發生變化。此外，自由OH預計會在壓縮單層時受到影響，正如之前所看到的自由OD。13在這里，我們同時測量了DPPC單層在不同密度下的表面活性劑和水分子。在傳統的SFG實驗中，樣品庫是固定的，隨著脂質密度的增加，光譜會發生階躍轉變，與水的光譜無法區分?空氣界面到一個具有更強烈的水光譜和CH模式的界面。在水光譜中觀察到的強度階躍與來自表面活性劑的CH信號完全相關。當樣品貯存器連續移動時，該強度步驟不存在。

 通過使用布魯斯特角顯微鏡（BAM），我們將表明，盡管表面活性劑在SFG中是不可見的，但它確實以非常低的密度存在于表面。BAM非常適合于在水面上顯示密度相對較高的表面活性劑區域。在布魯斯特角(～對于使用HeNe激光器的水，p偏振光的反射消失。然而，如果表面存在表面活性劑或脂質結構域，則可以看到它們，因為它們確實在布儒斯特角反射一些光。

 在此，我們研究了SFG信號中觀察到的不連續性在多大程度上是由測量方式引起的。我們發現，SFG在某些條件下具有侵入性：在低表面活性劑密度（即每分子面積>100?2）下，共振紅外（IR）激光脈沖對水面層的重復加熱導致高密度表面活性劑區域因熱梯度誘導的流動而從激光焦點處移位。在較高的平均表面活性劑密度下，激光誘導的熱梯度不再足以使疇遠離激光焦點，信號突然增加。這解釋了先前在低密度下觀察到的單分子膜SFG信號的不連續性。為了概括我們的結論，我們表明這種行為不僅在脂質單層中觀察到，而且在其他表面活性劑類型中也觀察到。我們研究了一種脂肪酸（棕櫚酸）和一種醇（1-十二醇）。此外，我們還報道了DPPC在低密度水中的真實無創SFG光譜(～300?2/分子）至高密度(～50?2/分子），通過使用旋轉槽。這些新結果顯示SFG信號逐漸增加。

 令人驚訝的是，在通過橢偏法獲得的橢圓度系數中，在低密度下也經常觀察到脂質和脂肪酸的類似步驟。14?18橢偏儀基本上是BAM的空間整合版本；i、例如，代替二維圖片，獲得橢圓系數。我們認為，橢偏測量中觀察到的強度階躍與SFG中的階躍具有不同的起源。單分子膜的加熱可以忽略不計，因為在橢偏儀中，激光與水不共振，且通量較低。我們發現，與SFG相比，橢圓偏振法的步驟取決于樣品制備。通過給分子時間和空間來放松，我們也可以消除這個步驟。

實驗部分

 對于SFG實驗，寬帶紅外脈沖（fwhm）為～200厘米?1）由泵送的OPG/OPA（TOPAS，光轉換）產生～來自相干Legend激光系統的1 W 800 nm脈沖（1 kHz，～120 fs半高寬）。同時,，～0.5 W的激光輸出通過標準具，產生窄帶VIS脈沖（12 490 cm?1.～30μJ，半高寬帶寬～15厘米?1）提供實驗的光譜分辨率。寬帶紅外脈沖允許同時檢測多種振動模式。紅外脈沖的中心是～3100厘米?1(～6μJ）用于檢測CH和氫鍵OH振動的實驗，并且～3700厘米?1(～3μJ）用于游離OH實驗。對于一些實驗，紅外中心頻率在2750到3750厘米之間連續變化（“掃描”）?1同時測量CH和全OH區域。從2750到3750再回到2750厘米大約需要一分鐘的時間?1.可見光和紅外光束的入射角分別為，～35°和～相對于表面法線為40°。可見光光束聚焦到約400μm的束腰。在兩次實驗之間改變了紅外焦點。大多數實驗都是在紅外焦點大小為的情況下進行的～200μm高斯光束束腰，產生～10兆焦耳/平方厘米。對于低通量(～1.5 mJ/cm2）實驗（圖5和圖7，頂部面板），我們移動紅外透鏡，以使樣品處的光束束腰減小～SFG光通過單色儀進行光譜分散，并通過電子倍增電荷耦合器件（EMCCD和或技術）進行檢測。在單層壓縮過程中，在固定的紅外頻率下，以30秒的采集時間連續測量SFG光譜。在紅外頻率在2750到3750厘米之間掃描的實驗中，采集時間為6（高通量）或10（低通量）分鐘?1.除非另有說明，否則SFG光譜在s偏振SFG、s偏振VIS和p偏振IR條件（SSP）下記錄，并標準化為取自z切割石英的參考光譜。

 對于布魯斯特角顯微鏡（BAM），使用配備50 mW 532 nm激光器的自制機器。19 p偏振光在表面上以大約布儒斯特角反射(～53°）并通過顯微鏡接收。由于單層在可視化軸上傾斜，圖像僅聚焦在窄條上。為了獲得足夠大的圖像，然后將通過在單層上不同水平聚焦形成的不同條帶的圖像并排放置。由此獲得了600μm×600μm的大圖像，空間分辨率接近1μm。

 使用兩種不同的橢偏儀進行橢偏測量。一個是在布魯斯特角工作的自制偏振調制機器(～53°），并配備一臺產生5 mW 632 nm光的激光器。另一種是商用零橢偏儀（Optrell），在50°角下以2 mW 632 nm的激光入射。對于橢偏儀和BAM，照明面積均為幾平方毫米。

 表面活性劑DPPC（1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿）、1-十二醇（C12H25OH）和棕櫚酸（C15H31COOH）分別從Avanti極性脂質、Fluka和Sigma-Aldrich中獲得，使用時無需進一步純化。單分子膜從氯仿溶液（DPPC）中擴散～0.5毫米，1-十二醇～3毫米，棕櫚酸～2毫米）在空氣中?H2O（微孔，18MΩcm）界面。通過兩種方法制備具有不同表面密度的單分子膜：通過在水面上散布0.5μL液滴的數量或通過壓縮該層來控制每個分子的面積。使用商用（芬蘭Kibron Inc.）張力計，使用指針測量表面壓力。由于橢偏測量結果取決于單層制備的方式，我們為每種類型的實驗提供了制備的明確描述。

 SFG。在我們連續掃描紅外頻率以立即獲得整個CH和OH光譜的實驗中，使用了自制的7×7 cm2特氟隆涂層槽（圖1和圖7，底部面板）。對于在激光發射之間（部分）刷新樣品的實驗，使用自制的圓形（直徑8 cm）特氟隆槽（圖5和圖6）。該槽使用一個簡單的12 V直流電動機旋轉，該電動機驅動一個自制的旋轉臺，其旋轉方式使樣品在激光焦點處以100%的速度移動～0.06 m/s。在這兩種情況下，每個分子的面積由散布在水面上的0.5μL液滴的數量控制。對于要求每個分子的面積具有高分辨率的實驗（圖2），我們使用了6×23 cm的商用金屬朗繆爾槽（芬蘭Kibron公司）。用一個速度在5至10 mm/min之間的屏障壓縮該層(～1.3?2.6?2/鏈/分鐘）。每個分子的初始面積由表面活性劑氯仿溶液中0.5μL液滴的數量控制。

 圖2。（a）DPPC的CH信號（綠色）、氫鍵OH信號（藍色）和自由OH信號（紅色）的表面壓力（黑色，左軸）和積分SFG強度（右軸），作為連續壓縮單層過程中每個分子面積的函數。為了清晰起見，集成SFG信號被歸一化，并且彼此之間具有小偏移。集成光譜區域由插圖中的彩色正方形標記，分別顯示CH/OH鍵合和游離OH區域中每個分子50和100?2的SFG光譜。相對較高的紅外通量(～已使用10 mJ/cm2）。（b）與（a）類似，但紅外功率降低了四倍，導致通量降低了四倍(～2.5 mJ/cm2）。插圖顯示了改變紅外注量對SFG信號出現的每個分子面積的影響。（c）類似于（a），但適用于棕櫚酸。（d）類似于（a），但對于1-十二醇。在這種情況下，未測量1-十二醇的游離OH。SFG結果是在SSP極化下獲得的。

 砰。在布魯斯特角顯微鏡（BAM）實驗（圖3）中，使用了面積為324 cm2的聚四氟乙烯槽。在沉積液滴后，每個分子的面積為150?2，通過用一個屏障壓縮單層來控制層的密度。在一定密度下，停止屏障以收集圖像。

 圖3。水上不同密度DPPC的布儒斯特角顯微鏡圖像。圖像大小為600×600μm。白色區域表示高密度，而黑色區域表示低密度。在每個面板中，每個分子的面積（單位為?2）在左下角報告，表面壓力（單位為mN/m）在右下角報告。這些照片是用自動調整靈敏度的相機拍攝的，這樣就無法比較圖像之間的灰度等級。

 橢偏儀。在一組實驗中，在最初沉積氯仿溶液液滴后，通過在6×23 cm的商用金屬朗繆爾槽（Kibron Inc.，芬蘭）中以5 mm/min的速度壓縮該層，并使用一個屏障（圖8a和8c）來控制表面積。在另一個實驗中，每個分子的面積由在自制的圓形（直徑8 cm）特氟隆涂層槽（圖8b）中水面上散布的0.5μL液滴數量控制。如下所示，對于以不同方式制備的單分子膜，可以獲得不同的結果。