１．１結晶方法（ＣｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）

 １．１．１分批結晶（ＢａｔｃｈＣｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ）這是最老的最簡單的結晶方法，其原理是同步地在蛋白質溶液中加入沉淀劑，立即使溶液達到一個高過飽和狀態。幸運的話，不需進一步處理即可在過飽和溶液中逐漸長出晶體。一個用于微分批結晶的自動化系統已被Ｃｈａｙｅｎ等人設計出（１９９１，１９９２），其微分批方法中，他們在１－２μｌ包含蛋白質和沉淀劑的液滴中生長晶體。液滴被懸浮在油（如石蠟）中，油的作用是作為封層以防止蒸發，它并不干擾普通沉淀劑，但是干擾能溶解油的有機溶劑（Ｃｈａｙｅｎ，１９９７；ｓｅｅａｌｓｏＣｈａｙｅｎ，１９９８）。

 １．１．２液－液擴散（Ｌｉｑｕｉｄ–ＬｉｑｕｉｄＤｉｆｆｕｓｉｏｎ）這種方法中，蛋白質溶液和含有沉淀劑的溶液是彼此分層在一個有小孔的毛細管中，一個測熔點用的毛細管一般即可（如圖１．２）。下層是密度大的溶液，例如濃硫酸銨或ＰＥＧ溶液。如果有機溶劑如ＭＰＤ被用作沉淀劑，它會在上層。以１：１混合，沉淀劑的濃度應該是所期最終濃度的二倍。兩種溶液（各自約５μｌ）通過注射器針頭導入毛細管，先導入下層的。通過一個簡易的搖擺式離心機去除氣泡。再加入上層，進而兩層之間形成一個明顯的界面，它們會逐漸彼此擴散。Ｇａｒｃ′？ａ－ＲｕｉｚａｎｄＭｏｒｅｎｏ（１９９４）已經發展液－液擴散技術至針刺法。蛋白質溶液通過毛細力被吸入狹窄的管中，管的一端是封閉的。接著，開放端被插入置于小容器的凝膠中，凝膠使得管豎直，蛋白質溶液與凝膠接觸。含有沉淀劑的溶液被倒在凝膠上，整個裝置被保存于封閉的盒子以防蒸發。沉淀劑通過凝膠和毛細管的擴散時間可以由毛細管插入凝膠的深度控制，從而蛋白質溶液中即可形成過飽和區域，毛細管底部高而頂部低。這也可作為一個篩選最佳結晶條件的額外信息。

１．１．３蒸氣擴散（ＶａｐｏｒＤｉｆｆｕｓｉｏｎ）

 １．１．３．１懸滴法（ＴｈｅＨａｎｇｉｎｇＤｒｏｐＭｅｔｈｏｄ）這種方法中，在一個硅化的顯微鏡蓋玻片上通過混合３－１０μｌ蛋白質溶液和等量的沉淀劑溶液來制備液滴。蓋玻片置于一個盤子的凹槽之上，凹槽的一部分填有所需的沉淀劑溶液約１ｍｌ。在蓋玻片放好之前，小室的凹槽周圍用油或油脂密封（如圖３）。

１．１．３．２沉滴法（ＴｈｅＳｉｔｔｉｎｇＤｒｏｐＭｅｔｈｏｄ）在懸滴法中，如果蛋白質溶

液表面張力很小就會在蓋玻片表面展開。此時，沉滴法更有利，圖４給出了沉滴法的簡圖。

 １．１．４透析法（Ｄｉａｌｙｓｉｓ）除了上述使得蛋白質結晶的方法，還有許多透析技術。透析的優點是沉淀溶液容易改變，對于適量的蛋白質溶液（多于０．１ｍｌ），可用透析管完成（如圖１．５ａ）。透析膜通過橡皮圈連在管子上，但在使用前要用水大量漂洗或最好在水中煮約１０ｍｉｎ。對微升量的蛋白質溶液而言，可以使用覆有透析膜的厚壁微毛細管（Ｚｅｐｐｅｚａｕｅｒｍｅｔｈｏｄ）或者樹脂玻璃紐扣（如圖１．５ｂ）。紐扣的缺點是紐扣中的蛋白質晶體不能通過極化顯微鏡觀察到。

 另一中微透析方法在圖１．６中有描述，將５μｌ蛋白質溶液注射到一個毛細管中，毛細管覆有透析膜，膜可用塑料管套緊。對蛋白質溶液進行簡單離心，然后用鑄模粘土將毛細管封閉，接著將毛細管放入含有透析液的Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中。

機遇造就第一個膜蛋白晶體結構的解析

 １９８８年諾貝爾化學獎被授予三位德國科學家，他們分別是哈特穆特·米歇爾（ＨａｒｔｍｕｔＭｉｃｈｅｌ）、約翰·戴森霍弗（ＪｏｈａｎｎＤｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ）和羅伯特·休伯（ＲｏｂｅｒｔＨｕｂｅｒ），以表彰他們對膜蛋白結構生物學的巨大貢獻。這三個人通力合作，在世界上首次解析了一種膜蛋白——紫細菌光合反應中心的高分辨率三維結構。紫細菌光合反應中心三維結構的解析，拉開了膜蛋白結構生物學的序幕，在生物學界影響非常大。然而，在這樣一個獲諾貝爾化學獎的重大研究成果背后，卻隱藏著一段不為人知的故事，其中就包涵了“抓住機遇發現科學事實”的科學方法論。

 蛋白質是構成生物體的最基本物質之一，它在生物體的各種生命活動中扮演著極其重要的角色，如催化體內幾乎全部反應的酶。在所有蛋白質中，膜蛋白的作用更為重要。膜蛋白位于細胞的膜系統上，充當很多角色，比如細胞膜上用來接受胞外信號的受體，以及用來轉運離子和分子的離子通道和轉運體。為了解釋蛋白質的具體作用機制，就必須在原子分辨率水平觀察到蛋白質的三維結構，以及蛋白質和與其相互作用的分子形成的復合物的結構。這要用到一種叫做Ｘ射線晶體學的方法。據統計，Ｘ射線晶體學已造就了十多個諾貝爾獎。使用這種方法的前提是得到所研究對象的高質量單晶，若要解析某個蛋白質的結構，就首先要生長出目標蛋白的單晶。這對于一般的胞內可溶性蛋白來說，似乎不是那么難。１９６２年，兩位英國科學家約翰·考德里·肯德魯（ＪｏｈｎＣｏｗｄｅｒｙＫｅｎｄｒｅｗ）和馬科斯·斐迪南·佩魯茲（ＭａｘＦｅｒｄｉｎａｎｄＰｅｒｕｔｚ）因對肌紅蛋白結構的研究而被授予當年的諾貝爾化學獎。這里說到的肌紅蛋白是一種胞內可溶性蛋白，而不是膜蛋白。可溶性蛋白的結晶雖然已經實現，但是這對膜蛋白來說還不能實現。由于膜蛋白具有很強的疏水性，在溶液中是難溶的，因此想要得到膜蛋白的晶體在當時被認為是不可能的，這一點已經寫進了當時的權威教科書。

 首次成功得到膜蛋白的晶體源于哈特穆特·米歇爾的一次偶然發現。米歇爾于１９４８年出生在德國符騰堡州的路德維希堡。大學畢業后，他在圖賓根馬普研究所的迪特爾·奧斯蒂希特（ＤｉｅｔｅｒＯｅｓｔｅｒｈｅｌｔ）實驗室做關于鹽桿菌的研究。當時，奧斯蒂希特與他人合作在鹽桿菌中發現了菌紫紅質，后來他提出菌紫紅質可看作皮特·米切爾（ＰｅｔｅｒＭｉｔｃｈｅｌｌ，１９７８年諾貝爾化學獎獲得者）的化學滲透理論框架中的光驅動的質子泵。米歇爾于１９７７年在維爾茨堡馬普研究所取得博士學位后，作為課題的延續，他打算將脫脂的菌紫紅質與細菌囊泡進行融合，以實現光驅動的氨基酸攝入。當樣品在冰箱里貯存期間，米歇爾偶然發現脫脂的菌紫紅質形成了固態的玻璃狀聚集體。基于這個發現，他確信應該可以生長出像菌紫紅質這樣的膜蛋白的晶體，雖然這在當時被認為是不可能的。米歇爾關于結晶菌紫紅質的想法得到了他的導師奧斯蒂希特的鼓勵和支持，于是實驗正式啟動。四周后，米歇爾就得到了菌紫紅質的二維晶體，但不是他所想要的用來做Ｘ射線衍射實驗的三維晶體。功夫不負有心人，終于在１９７９年４月，米歇爾得到了第一個真正的菌紫紅質三維晶體。于是，他取消了去美國攻讀博士后的計劃，把全部精力投在了繼續生長菌紫紅質晶體上。

 雖然得到了菌紫紅質的三維晶體，但是當米歇爾進行Ｘ射線衍射實驗時，發現該晶體內部堆積混亂，而且晶體又小，不足以進行結構分析。此外，由于當時德國沒有Ｘ射線衍射儀，他只能去英國劍橋去試晶體。在劍橋，很多晶體學家則要做關于可溶性蛋白晶體的Ｘ射線衍射實驗，所以即使米歇爾去了英國，也幾乎沒有機會能用上Ｘ射線衍射儀。然而，他沒有浪費時間，而是在這段時間對菌紫紅質的晶體進行了優化。后來，米歇爾回到德國，他所在實驗室的主任羅伯特·休伯決定購買一臺Ｘ射線衍射儀以滿足米歇爾的實驗需要，可惜的是菌紫紅質的晶體質量一直沒能提高。

 盡管遭受重大挫折，但是米歇爾根據他最初的觀察和分析，堅信自己一定能長出高質量的膜蛋白單晶。于是，他嘗試去結晶別的膜蛋白，其中最有希望的膜蛋白——紫細菌光合反應中心被成功結晶了，而且衍射質量非常好，這是在１９８１年９月。在Ｘ射線衍射儀上收集了大量數據后，米歇爾就開始了結構分析工作。后來，約翰·戴森霍弗也加入到了這個課題研究中來。最終，他們成功解析了紫細菌光合反應中心的三維結構，分辨率為３埃，文章發表于１９８５年Ｎａｔｕｒｅ雜志上。僅僅三年后，米歇爾、戴森霍弗和休伯就被授予１９８８年諾貝爾化學獎，這不能不說是一個奇跡，因為獲得諾貝爾獎的成果大多是要經過十年以上的等待后才被授予諾貝爾獎的。

 米歇爾獲諾貝爾獎時只有４０歲，這在諾貝爾化學獎獲得者中是相當年輕的。米歇爾不僅是解析第一個膜蛋白三維結構的最大貢獻者，還是后來膜蛋白結晶技術發展過程中抗體片段介導的膜蛋白結晶法的發明者。由米歇爾等三位諾貝爾化學獎獲得者開啟的膜蛋白結構生物學現在已經非常熱門。２００３年諾貝爾化學獎再一次被授予解析細胞膜上的鉀離子通道和水通道的兩位美國科學家——羅德里克·麥金農（ＲｏｄｅｒｉｃｋＭａｃｋｉｎｎｏｎ）和皮特·阿格雷（ＰｅｔｅｒＡｇｒｅ）。回顧米歇爾成功結晶第一個膜蛋白的歷程，１９７７年的那次偶然發現是至關重要的。如果當時他沒有仔細觀察，或者觀察到了卻沒當作一回事，那么他也就不會去嘗試結晶膜蛋白了，更不會獲得諾貝爾獎了。正是由于他抓住了那次機遇，進行了認真分析后，堅信自己一定能生長出當時被認為不可能的膜蛋白晶體。于是，他那樣做了，他打破常規的創新想法受到了導師的大力支持，最終他成功了！

 像這樣的例子還有很多，比如日本科學家白川英樹發現導電塑料，華裔科學家錢永健發明鈣染料等。無數科學研究上的成功案例告訴我們：一定要抓住機遇發現科學事實！同時，必須記住：機遇只偏愛有準備的頭腦。在科研過程中，我們應該隨時準備著去發現，去思考，去探索！

諾貝爾化學獎之核糖體的精細復雜的晶體結構

 真的沒有想到今年的諾貝爾化學獎會頒給核糖體的結構研究，不過還是非常興奮的，因為本人亦在從事通過Ｘ射線晶體學解析蛋白質結構領域的研究。曾經就覺得解析核糖體（由大、小兩個亞基構成）的晶體結構的文章很不平凡，因為報道大亞基結構的文章在Ｓｃｉｅｎｃｅ上撰寫了１６頁（普通文章４頁左右）；剛查到報道小亞基結構的文章亦在Ｎａｔｕｒｅ上撰寫了１３頁（普通文章６頁左右）。

 這兩篇文章以及另一篇解析核糖體小亞基的文章都發表于２０００年，也就是說短短過了９年，三位負責人就獲得了諾貝爾獎。當然這里說短短其實已經非常長了（原因下一篇再談，呵呵）。

接下來，就來看看他們三位的絕世文章及里面的精美圖片吧！

蛋白質結晶系列之一（自譯）

１．蛋白質結晶（ＣｒｙｓｔａｌｌｉｚｉｎｇａＰｒｏｔｅｉｎ）

１．１引言（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）

 當別人在談論傅立葉和帕特森，或者分子置換及分子動力學改良時，新到蛋白質Ｘ射線晶體學實驗室的同學們可能會迷惑。然而，他們立即會明白要想確定蛋白質的結構，首先必須生長出合適的晶體。沒有晶體，便談不上用Ｘ射線確定蛋白質結構。這一章，我們討論蛋白質晶體生長的原理。作為實踐，我們將給出結晶溶菌酶的方法。我們還將得到一個溶菌酶晶體的Ｘ射線衍射圖像，

這將提供對Ｘ射線衍射的簡介。這一章包括一個關于常見問題的討論。

 １．２蛋白質結晶原理（ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＣｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ）

 蛋白質的Ｘ射線結構分析首先要獲得合適的單晶。蛋白質結晶學尚未發展成熟，盡管很受人親睞，特別是受航天飛機中微重力實驗（Ｋｕｎｄｒｏｔｅｔａｌ．，２００１；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎｅｔａｌ．，１９９５）的激發。蛋白質結晶是一個反復試驗的過程，蛋白質逐漸會從溶液中析出，雜質、晶核及其他未知因素對此過程有所影響。通常，蛋白質越純，生長晶體幾率越大。蛋白質結晶學者對蛋白質的純度要求要嚴于生化學家的要求，后者往往在酶催化活性足夠高時就很滿意。另一方面，為了使蛋白質結晶，不僅要加其他成分，所有蛋白質分子的表面性質也必須是相同的，特別是表面的電荷分布，因為它影響晶體內分子的聚集。質譜是蛋白質結晶中的一種有效工具，例如檢測重組蛋白的表達、樣品純度、重原子衍生物及蛋白質結構的特性（Ｃｏｈｅｎ，１９９６；Ｐｏｔｉｅｒｅｔａｌ．，２０００）。

蛋白質結晶涉及四個重要步驟如下：

１．蛋白質純度的確定。如果不夠非常純，必須要進一步純化。

 ２．蛋白質溶解于合適的溶劑中，從中它能通過一種鹽或有機化合物而析出。溶劑通常是水－緩沖劑溶液，有時加有機溶劑，如２－甲基－２，４－戊二醇（ＭＰＤ）。正常情況下，沉淀劑也被加入，但是濃度不高于使沉淀產生。對于不溶于水－緩沖劑或水－有機溶劑的膜蛋白，還需要加入去污劑。

 ３．使溶液過飽和。在這一步中，小聚集體形成，它是晶體生長所需的核。對小分子的結晶來說，相比于蛋白質更為人熟知，晶核的自發形成需要提供表面張力能。一旦這個能障被突破了，晶體開始生長。能障在高水平的過飽和度時很容易克服。因此，在高過飽和度時，晶核更易自發形成。晶核的形成可作為一個過飽和度和其他參數的函數通過多種方法來研究，包括光散射、熒光去極化及電子顯微鏡。

 ４．一旦晶核形成，晶體生長正式開始。對低分子量的化合物而言，新分子會逐步結合到正在生長的晶體表面。這是由于這些位置的結合能比較大，相對于分子結合到平滑的表面。這些步驟要么由晶系缺陷造成，要么發生在表面隨機形成的晶核。

蛋白質結晶系列之二（自譯）

 理論告訴我們，最好的晶體生長要減少過飽和度到一個低的水平；維持高飽和度可能導致過多晶核的形成，從而產生很多小晶體（如圖１．１）。同時，晶體需要緩慢地生長以在表面達到一個最高的有序度。然而實際中，并沒有遵從這個基本規則。最簡單的改變過飽和度的方式是改變溫度或沉淀劑的濃度。

 蛋白質沉淀可以通過添加鹽、聚乙二醇或有機溶劑。作為沉淀劑，鹽有雙重作用，即鹽析和鹽溶。鹽離子屏蔽了蛋白質分子表面的電荷，因此從而減弱了分子間的排斥力。此外，部分水被固定從而不可與蛋白質結合，因為鹽離子周圍形成水化層。最常用的鹽是硫酸銨，其優點是溶解性好，對大多數蛋白質無損害，即使濃度很高。

 聚乙二醇對水有高親和性，能像鹽那樣固定水。而且，它以不同的方式影響蛋白質的溶解度。ＰＥＧ分子不能超過其半徑而更接近蛋白質分子表面，蛋白質分子周圍有ＰＥＧ中心不能接近的水化層。如果蛋白質分子聚集，這些水化層

 部分重疊，從而不可接近的區域變小。結果，可接近區域變大。從而有更多的空間對ＰＥＧ分子可用，它們的熵增加（以一些蛋白質熵為代價），系統的自由能降低。因此，蛋白質分子聚集的這種情況在使用ＰＥＧ時是最有利的。

 蛋白質結晶中最普遍的有機溶劑是ＭＰＤ。有機溶劑具有靜電效應，它們能降低介質的的介電常數。靜電力變強，從而壓縮蛋白質分子周圍離子的雙電層。這些分子可以彼此更加接近，如果在一個有利的方向，它們便可以聚集。

 一些蛋白質在水中溶解度不好，但是如果加入少量鹽（比鹽析少的多）就可溶解。移除鹽后，蛋白質便會析出。這種鹽溶效應可以解釋為蛋白質分子表面帶電基團和溶液中離子相互競爭的結果。在有溶劑離子時，蛋白質分子不會被離子雙層包圍，而能通過不同蛋白質分子上異種電荷之間的庫侖力相互聚集。如果少量離子被加入，蛋白質周圍會形成離子雙層，它們彼此之間不擴散不排斥。

其他降低蛋白質溶解度的方法有改變溶液ｐＨ或溫度。

綜上所述，通常結晶蛋白質的步驟如下：

１．仔細檢測純度。

２．ａ．慢慢增加沉淀劑的濃度，如ＰＥＧ、鹽或有機溶劑等。

ｂ．改變ｐＨ或溫度。

 實際中，通常可用作結晶實驗的蛋白質的量非常少。要確定最好的結晶條件，經常需要進行大量的實驗。因此，每次實驗應該用最少量的蛋白質。一個合理大小（０．２×０．２×０．２ｍｍ＝０．００８ｍｍ３）的蛋白質晶體重約１０μｇ。因此，１ｍｇ純化的蛋白質可以足夠做大約１００次結晶實驗。

 膜蛋白在水中不溶解，因此很難結晶。通常的策略是使用洗滌劑將其溶解于水溶液中，然后采用水溶性蛋白的操作程序（Ｍｉｃｈｅｌ，１９９０；Ｓｏｗａｄｓｋｉ，１９９４）。Ｌａｎｄａｕ和Ｒｏｓｅｎｂｕｓｃｈ（１９９６）引進一種新的方法能夠結晶膜蛋白。他們采用脂立方相作為各種化合物結晶的母體，脂立方相是具有立體對稱性的液晶，它們能在脂和水的混合物中形成（ＬｉｎｄｂｌｏｍａｎｄＲｉｌｆｏｒｓ，１９８９）。一些類型的脂立方相是存在的。Ｌａｎｄａｕ等人（１９９７）成功地在某一類型脂立方相中生長出了高度有序的細菌視紫紅質（ｂａｃｔｅｒｉｏｒｈｏｄｏｐｓｉｎ）膜蛋白晶體（ｓｅｅａｌｓｏＧｏｕａｕｘ，１９９８）。但仍要看是否這種方法在結晶更多膜蛋白中取得成功。

科研中沒有不可能的事！請看這里

 １９７９年以前幾乎沒有人認為膜蛋白可以得到晶體，用于Ｘ射線衍射分析；德國科學家哈特姆特·米歇爾不信，他從７９年開始著手膜蛋白的結晶。結果，于１９８５年成功解析世界上第一個膜蛋白－紫細菌光合反應中心！于１９８８年獲得諾貝爾化學獎。

 離子通道被人們證實了多年，但一直未能得到其晶體結構。１９９８年，美國科學家麥克金龍等成功得到了鉀通道的晶體結構，從而開辟了離子通道研究的新時代！于２００３年獲得諾貝爾化學獎。

 多年來人們一直認為β腎上腺素受體的晶體結構是不可能得到的，結果就在去年，美國科學家終于得到了！β腎上腺素受體屬于Ｇ蛋白偶聯的受體。當今，有５０％以上的藥物的靶點都在Ｇ蛋白偶聯的受體，可見其重要性。在人體內，Ｇ蛋白偶聯受體是多種激素、神經遞質等發揮作用所必不可少的！至今獲得高分辨率解析的只有視紫紅質和β１和β２腎上腺素受體，然而，Ｇ蛋白偶聯受體家族有五大類共８００多種蛋白，看來要搞清楚這些還有很長一段路要走。同是在２００７年，１２月的一期Ｎａｔｕｒｅ雜志上刊登了一位科學家的三篇文章，分別是關于Ｎａ＋，Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ、Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ和

 Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ的晶體結構及作用機制解析，這三者是在離子跨膜主動運輸中發揮著“泵”的作用的三種重要的跨膜蛋白。

什么叫不可能？沒有什么不可能！大家務必記住這一點！