研究簡介：選擇性和滲透率通過界面聚合，制備了頂層薄而致密的復合膜。雖然優化這種膜是很先進的，但在這種密集的選擇層上傳輸需要高跨膜壓力和高能量消耗。在細胞尺度上，生物膜滿足上述許多標準。生物膜將細胞或細胞組分分開，并且主要由厚度小于10nm的致密磷脂雙層組成。磷脂雙層包含膜蛋白，其使得信號傳遞和分子選擇性轉運穿過膜。連接膜兩側的膜蛋白被稱為跨膜蛋白，并且一些跨膜蛋白（TP）形成納米孔。研究人員將鐵蛋白聚合物偶聯到超薄膜上，并通過蛋白質變性形成納米孔。使用天然成孔跨膜蛋白代替鐵蛋白，合成了跨膜蛋白（TP）聚合物綴合物，其通過在Pickering乳液界面處的組裝和隨后的聚合物鏈的UV交聯轉化成穩定的膜。提出了一個簡單的方法集成到平面超薄膜的功能性跨膜蛋白（TP），這種策略是基于Langmuir技術和同雙官能團交聯劑戊二醛，是一種有效的蛋白質交聯劑和已知的不影響蛋白質構象在許多情況下。在研究中，FhuA分子在朗繆爾槽的空氣-水界面處鋪展。在用Langmuir槽的兩個可移動屏障壓縮時，形成致密的2D膜并通過戊二醛交聯穩定。使用Langmuir-Schaefer方法將單層或多層交聯的FhuA膜轉移到各種基底材料上。

Kibron LB 膜分析儀的的應用

 用乙醇徹底清潔Langmuir槽，用Millipore純水沖洗，并填充磷酸鹽緩沖液。隨后，將Langmuir槽的屏障完全封閉，吸附的顆粒從空氣-水界面吸走，磷酸鹽緩沖液從屏障后面重新填充。重復該過程，直到在完全屏障壓縮時測量的清潔空氣-水界面的表面壓力的上升小于或等于0.05mN/m-1在典型的膜制造實驗中，將50μL FhuA溶液（FhuA濃度為6.3×10-6 M的MPD緩沖液中）加入到反應器中。平衡2小時后，將朗繆爾槽的屏障設置為以1 mm/min的速度運動將吸附的FhuA單層壓縮至25 mN/m的表面壓力，在保持表面壓力恒定的同時，將1.76mL戊二醛溶液（50wt%的H2O溶液）加入到反應器中。在空氣中干燥之前，將轉移的FhuA膜在MPD溶液（5%體積MPD的Millipore純水溶液）中通過浸漬三次來洗滌。平衡2小時后，Langmuir槽的屏障以1 mm min-1的速度運動，將吸附的FhuA單層壓縮到25 mN m-1的表面壓力。在保持表面壓力不變的情況下，將1.76 mL戊二醛溶液(50 wt%in H2O,Sigma-Aldrich,USA)從Langmuir槽屏障后注入磷酸鹽緩沖亞相。交聯至少進行2小時，直到FhuA膜按照Langmuir-Schaefer方法轉移到相應的底物上。在空氣中干燥之前，將轉移的FhuA膜在MPD溶液(5 vol%MPD在Millipore純凈水中)中浸洗三次。

實驗結果

 介紹了一種制造超薄但機械穩定的膜的新方法，該膜包含TP FhuA，其天然形成限定的納米孔。由于其厚度低和本研究中推斷的極高密度的集體對齊蛋白質，與常規納濾膜相比，這種膜具有非常高的水滲透性。由兩種不同的FhuA變體制成的膜反映了每種變體的分子性質，在此關于離子滲透性進行了證明。我們的膜有潛力作為一個平臺技術，允許定制膜根據個人的過程要求。膜制造使用了研究良好的Langmuir技術和一個共同的蛋白質交聯劑，這確保了良好的可擴展性，著眼于未來的應用。

 圖1、跨膜蛋白FhuA的交聯2D膜片。a）使用β-桶蛋白FhuA（跨膜蛋白鐵羥酸鹽攝取蛋白組分A）的兩種變體。在FhuA WT中，軟木結構域阻塞大部分孔內部，而該軟木結構域被生物技術去除以形成開孔變體FhuA?CVF電子伏特兩種FhuA變體具有相同的尺寸，并且其特征在于蛋白質上部的親水性環區和蛋白質下部的疏水性跨膜區。b）應用Langmuir技術形成超大2D FhuA膜片。（i）由于它們的兩親性，當擴散到空氣-水界面時，FhuA分子占據很大程度上直立的取向。（ii）當在朗繆爾槽的屏障之間緊密壓縮并與戊二醛交聯時，FhuA膜片可以通過重復的水平浸漬層疊在基底的頂部。c）由FhuA WT（左）或FhuA?CVF制成的膜的示意性俯視圖電子伏特d）FhuA膜在水和離子滲透方面進行表征。

 圖2、a）在空氣-水界面處的FhuA膜并轉移到基底上。（i）吸附，（ii）壓縮，和（iii）在膜制造期間從0.32nmol FhuA WT涂布在磷酸鹽緩沖液頂部測量的谷面積-時間曲線在（ii）和（iii）中，戊二醛的注射用箭頭標記。B）相應的BAM成像顯示（i）在高達30 mN/m的表面壓力下均質的FhuA膜-1.（ii）表面壓力超逾30mN/m）（i）一個或（ii）兩個FhuA膜片的AFM圖像，所述膜片層疊在硅基底的頂部上（左半部分用注射器尖端刮去）。高度分布屬于圖像中的虛線，并且指示（i）5和（ii）9 nm的膜厚度。d）單個FhuAΔCVF的共聚焦熒光顯微鏡圖像，用熒光標記物標記的硅襯底上的薄膜片e）獨立地覆蓋TEM網格（淺灰色）的結構化碳膜中的孔（深灰色）的FhuA WT膜的HIM圖像。黑色區域顯示膜中的缺陷。

 圖3、空氣-水界面處的FhuA膜BAM（布呂斯特角顯微鏡）圖。(a)在MPD緩沖液中擴散FhuA WT之前和(b)之后的Langmuir槽氣-水界面BAM圖像;和(c-f)在不同表面壓力下的屏障壓縮。涂敷后立即在空氣-水界面上吸附一層致密均勻的FhuA WT膜。FhuA WT膜可以被壓縮到高達25 mN/m的表面壓力，而不會表現出不均勻性。在表面壓力為30 mN/m時，在FhuA WT薄膜中可以看到垂直于壓縮方向的細長裂紋。

 圖4、在FhuA單層膜上的AFM測量.a）當（i）未覆蓋和（ii）覆蓋有FhuA膜時在其中心具有單個孔的氮化硅膜窗口的示意圖.（iii）在PeakForce QNM模式下AFM成像期間FhuA膜涂覆的氮化硅膜窗口的橫截面（b-d）當（b）孔未被FhuA膜覆蓋，（c）孔被破裂的FhuAΔCVF膜覆蓋時，氮化硅膜窗口中的孔的AFM高度圖像膜，和（d）孔被一個完整的FhuAΔCVFtev膜層覆蓋（d）和（e）中的高度和變形圖像是同時獲得的，并且所有圖像都是在水中測量的。（d）和（e）中的高度和變形曲線分別屬于圖像中的虛線。

 圖5、通過FhuA膜的水和離子滲透。a）覆蓋有氮化硅膜窗口的充水容器的示意圖，其用于測量FhuA WT膜的水滲透。由從杯內到杯外的水蒸氣壓差驅動（pi-p0）（a）中所示的杯子的照片。c）FhuA WT膜的水滲透性為3.87×104 mol Pa-1 m?2 s-1（空參考25.13×104 mol Pa-1 m?2 s-1誤差條表示至少三個樣品的平均值的標準誤差。d）用于測量FhuA膜的離子滲透性的實驗裝置的示意圖。離子在電極之間擴散的唯一方式是滲透氮化硅膜窗口中的孔頂部的FhuA膜。e）在磷酸鹽緩沖液（10×10?3 m NaCl，10×10?3 m恒定斜率對應于4.0mS（空參比）、3.4mS（FhuA?CVF）、3.4mS（FhuA?CVF）和3.4mS（FhuA?CVF）的電極之間的恒定電導.

總結

 通過具有納米孔的膜的過濾通常與高跨膜壓力和高能量消耗有關。這個問題可以通過減少各自的膜厚度來解決。本研究描述了一種簡單的方法來制備基于蛋白質納米孔的超薄膜，該膜具有優異的透水性，比同類工業應用膜高出兩個數量級。此外，結合封閉或開放的蛋白質納米孔可以調整膜的離子滲透性。為了形成這樣的膜，跨膜蛋白鐵羥酸鹽攝取蛋白組分A(FhuA)或其開孔變體在Langmuir槽的空氣-水界面組裝，壓縮成致密膜，通過戊二醛交聯，并轉移到各種支撐材料上。這種方法可以制備具有高密度蛋白質納米孔的單層或多層膜。通過原子力顯微鏡(AFM)、氦離子顯微鏡和透射電子顯微鏡可以看到覆蓋直徑達5μm孔的獨立膜。AFM最大推力定量納米力學性能映射(PeakForce QNM)表明，厚度僅為5 nm的獨立單層膜具有顯著的力學穩定性和彈性性能。這種新型蛋白質膜可以為節能納濾鋪平道路。